副猪嗜血杆菌的血清分型方法、引物组合以及PCR体系[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 110205395 A(43)申请公布日 2019.09.06

(21)申请号 201910520600.3(22)申请日 2019.06.17

(71)申请人 武汉科前生物股份有限公司

地址 430000 湖北省武汉市东湖新技术开

发区高新二路419号(72)发明人 徐高原　王召贺　汤细彪　周明光　

郝根喜　张华伟　(74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限

公司 11002

代理人 商秀玲(51)Int.Cl.

C12Q 1/6(2018.01)C12Q 1/686(2018.01)C12Q 1/04(2006.01)C12N 15/11(2006.01)

(54)发明名称

副猪嗜血杆菌的血清分型方法、引物组合以及PCR体系(57)摘要

本发明提供了副猪嗜血杆菌的血清分型方法、引物组合以及PCR体系，本发明为15种血清型的副猪嗜血杆菌分别设计特异性引物，序列为：SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.30，并将15对特异性引物分成六组，每组包括1至3对引物，每个PCR体系包括一组引物，整体构成一个多重PCR体系；后以待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株基因组DNA为模板，分别使用上述六组引物进行PCR检测，结果和参考菌株条带进行比对。本发明通过将引物进行分组后进行多重PCR，使用6个PCR体系，比一般的PCR方法的15个体系大幅简化，节约鉴定血清型的成本，同时不同血清型的特异性条带区别明显，使得本发明可以准确鉴定出副猪嗜血杆菌的15种血清型。

权利要求书2页 说明书7页序列表5页 附图8页

CN 110205395 ACN 110205395 A

权　利　要　求　书

1/2页

1.副猪嗜血杆菌的血清分型方法，其特征在于，包括：

为15种血清型的副猪嗜血杆菌HPS每种设计一对特异性引物，序列为：SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.30，

将上述15对特异性引物进行分组：G1组包含SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.11-12和SEQ ID NO.27-28所示序列的特异性引物；

G2组包含SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.15-16和SEQ ID NO.17-18所示序列的特异性引物；

G3组包含SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.13-14和SEQ ID NO.25-26所示序列的特异性引物；

G4组包含SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10和SEQ ID NO.19-20所示序列的特异性引物；

G5组包含SEQ ID NO.21-22和SEQ ID NO.29-30所示序列的特异性引物；G6组包含SEQ ID NO.23-24所示序列的特异性引物；以待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株基因组DNA为模板，分别使用上述六组引物进行PCR检测，结果和参考菌株条带进行比对。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为2型时在G1泳道150bp和G2泳道295bp处有特异性条带。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为11型时G1泳道150bp和G5泳道468bp处都有特异性条带。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为5型时仅在G4泳道519bp处有特异性条带。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为12型时在G4泳道519bp和G6泳道532bp处有特异性条带。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR检测条件如下：10μL反应体系：2×Premix Taq 5μL，10mmol/mL引物各0.4μL，模板DNA 0.5μL，然后加入无菌双蒸水或超纯水补足至10μL；

PCR反应程序：95℃预变性5min；然后95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸10min。

7.用于副猪嗜血杆菌血清分型的引物组合，其特征在于，引物以如下方式分组：第一组包含SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.11-12和SEQ ID NO.27-28所示核苷酸序列；第二组包含SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.15-16和SEQ ID NO.17-18所示核苷酸序列；第三组包含SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.13-14和SEQ ID NO.25-26所示核苷酸序列；第四组包含SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10和SEQ ID NO.19-20所示核苷酸序列；第五组包含SEQ ID NO.21-22和SEQ ID NO.29-30所示核苷酸序列；第六组包含SEQ ID NO.23-24所示核苷酸序列。8.含有权利要求7所述的引物组合的试剂盒。

9.权利要求7所述的引物组合在制备副猪嗜血杆菌15种血清型检测试剂盒或诊断试剂中的应用。

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权　利　要　求　书

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10.用于副猪嗜血杆菌血清分型的多重PCR体系，其特征在于，含有SEQ ID NO.1-30所示核苷酸序列的DNA片段。

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说　明　书

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副猪嗜血杆菌的血清分型方法、引物组合以及PCR体系

技术领域

[0001]本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及副猪嗜血杆菌的血清分型方法、引物组合以及PCR体系。

背景技术

[0002]副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是猪格拉瑟氏病的病原菌，一种革兰氏阴性菌，可引起猪的浆膜炎、脑膜炎和关节炎等炎症，给养殖业造成重大损失。HPS菌体在显微镜下可呈现多种形态，如球状、长杆状、或丝状，通常有荚膜，体外存活较难，其生长依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。HPS的血清型众多，现在已知比较常见的有15种血清型，每种血清型毒力不同，相互之间缺乏交叉保护，因此需要针对不同的血清型制备不同的疫苗来预防HPS的感染，对HPS菌株血清型的鉴定就显得尤为重要。[0003]目前HPS的血清分型方法很多，比较常用的传统分型方法是琼脂扩散法(GD)和间接凝集试验(IHA)，但这两种方法耗时长、敏感性低、准确性不高，鉴定时所需要的标准阳性血清制备十分麻烦，购买的价格十分昂贵，而且都至少有20％的菌株不能分型。随着聚合酶链式反应(PCR)方法的兴起，很多学者开始在分子水平上探究HPS的血清分型方法。目前已有很多可用于HPS分型的PCR方法见于报道。由于HPS的血清型主要取决于荚膜合成基因簇控制合成的荚膜的抗原性，因此这种方法一般是基于荚膜合成基因簇设计血清特异性引物，再将菌株模板与不同的引物在PCR体系中扩增，根据扩增出的特异性条带对HPS进行分型，很少出现不能分型的菌株。这样的方法虽然比GD和IHA已经减少很多工作量，但其需要15个PCR体系，并且分型效率依然不高，而且由于5型和12型的荚膜合成基因簇完全一致，难以区分，因此大多数的PCR分型方法不能将5型和12型区分开，检出范围有限。[0004]综上所述，现有的HPS血清分型方法中，传统的GD和IHA法费时费力，准确性和灵敏性都不高，越来越难以满足研究和生产的需要，已有的PCR分型方法虽然在一定程度上能够克服传统分型方法的缺陷，但其分型效率仍待提高，并且不能完全区分15种血清型的副猪嗜血杆菌，尤其是5型和12型，存在很大的局限性。发明内容

[0005]为克服上述副猪嗜血杆菌传统分型方法和现有PCR分型方法的缺陷，本方案设计了一种多重PCR的分型方法，可在高准确性、高灵敏性的基础上，减少时间和试剂成本，并可同时对大量菌株的血清型进行鉴定。[0006]第一方面，本发明提供一种副猪嗜血杆菌的血清分型方法，包括：为15种血清型的副猪嗜血杆菌每种设计一对特异性引物，序列为：SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.30，所述15种血清型分别是副猪嗜血杆菌血清1-15型。[0007]将上述15对特异性引物进行分组：[0008]G1组包含SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.11-12和SEQ ID NO.27-28所示序列的特异性引物；

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CN 110205395 A[0009]

说　明　书

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G2组包含SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.15-16和SEQ ID NO.17-18所示序列的特异

性引物；

[0010]G3组包含SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.13-14和SEQ ID NO.25-26所示序列的特异性引物；

[0011]G4组包含SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10和SEQ ID NO.19-20所示序列的特异性引物；

[0012]G5组包含SEQ ID NO.21-22和SEQ ID NO.29-30所示序列的特异性引物；[0013]G6组包含SEQ ID NO.23-24所示序列的特异性引物；[0014]以待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株基因组DNA为模板，分别使用上述六组引物进行PCR检测，结果和参考菌株条带进行比对。[0015]本领域技术人员能够理解，对于副猪嗜血杆菌的血清分型方法并非完全属于疾病诊断方法，在生物制品制备、生物制品质量控制领域，本发明的上述方法也具有良好的应用前景。

[0016]优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为2型时在G1泳道150bp和G2泳道295bp处有特异性条带。[0017]优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为11型时G1泳道150bp和G5泳道468bp处都有特异性条带。[0018]优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为5型时仅在G4泳道519bp处有特异性条带。

[0019]优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为12型时在G4泳道519bp和G6泳道532bp处有特异性条带。[0020]优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为1型时在G1泳道150bp处有特异性条带。

[0021]优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为3型时在G3泳道397bp处有特异性条带。

[0022]优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为4型时在G4泳道347bp处有特异性条带。

[0023]优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为6型时在G1泳道550bp处有特异性条带。

[0024]优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为7型时在G3泳道484bp处有特异性条带。

[0025]优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为8型时在G2泳道699bp处有特异性条带。

[0026]优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为9型时在G2泳道419bp处有特异性条带。

[0027]优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为10型时在G4泳道942bp处有特异性条带。

[0028]优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为13型时在G3泳道685bp处有特异性条带。

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CN 110205395 A[0029]

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优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为14型时在G1泳道975bp处有特异性优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为15型时在G5泳道287bp处有特异性

条带。

[0030]

条带。

[0031]

优选地，PCR扩增条件如下：

[0032]10μL反应体系：2×Premix Taq 5μL，10mmol/mL引物各0.4μL，模板DNA 0.5μL，然后加入无菌双蒸水或超纯水补足至10μL；[0033]PCR反应程序：95℃预变性5min；然后95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸10min。[0034]电泳成像条件：用1％浓度的琼脂糖凝胶在150V电压下电泳20min，凝胶成像系统观察每组引物扩增的目的条带大小。[0035]第二方面，本发明提供了一种用于副猪嗜血杆菌血清分型的引物组合，分组方式如下：

[0036]第一组包含SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.11-12和SEQ ID NO.27-28所示核苷酸序列；[0037]第二组包含SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.15-16和SEQ ID NO.17-18所示核苷酸序列；

[0038]第三组包含SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.13-14和SEQ ID NO.25-26所示核苷酸序列；[0039]第四组包含SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10和SEQ ID NO.19-20所示核苷酸序列；

[0040]第五组包含SEQ ID NO.21-22和SEQ ID NO.29-30所示核苷酸序列；[0041]第六组包含SEQ ID NO.23-24所示核苷酸序列。[0042]第三方面，本发明提供了一种血清分型方法和引物组合在制备副猪嗜血杆菌检测试剂盒或诊断试剂中的应用。[0043]第四方面，本发明提供了一种用于副猪嗜血杆菌血清分型的多重PCR体系，包括SEQ ID NO.1-30所示核苷酸序列的DNA片段。[0044]与已有的HPS分型方法相比，本发明的有益效果如下：[0045]1、本方案所提供的HPS的多重PCR分型方法可在短时间内实现对HPS血清型的鉴定，相比与传统的GD和IHA法更简便快捷，可省去大量的人力物力，节约鉴定血清型的成本。[0046]2、本方案所提供的对HPS的多重PCR分型方法使用6个PCR体系，相比于现有PCR方法的15个体系大幅简化，同时10μL PCR体系所使用的试剂更少，效率更高。[0047]3、本方案所提供的对HPS的多重PCR分型方法可以准确鉴定HPS的15种血清型，特别是分辨5型和12型，检出率更高，检出范围更大。附图说明

[0048]图1为本发明实施例2提供的血清型1-15的HPS菌株特异性条带电泳图；

[0049]图2-图16分别为本发明实施例3提供的血清型1-15的HPS菌株基因组DNA模板在6个引物分组体系中扩增得到的参考菌株条带电泳图，图中G1-G6泳道对应以G1-G6六个引物

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分组为引物进行PCR的结果条带。

具体实施方式

[0050]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0051]实施例1引物分组体系的建立

[0052]本实施例通过比对15个血清型HPS合成基因簇中的保守基因，对每个血清型设计特异性引物，为使同一PCR体系中引物不易反向互补形成二聚体，以及易于区分扩增子的大小，将所述特异性引物分为6组，具体如下：

[0053]

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实施例2 HPS菌株各血清型引物特异性实验

[0056]本实施例通过如下方法获得各血清型特异性条带：

[0057]1)将15种血清型的HPS菌株分别在TSA培养基平板上划线，培养出单菌落，挑取单菌落，水浴煮沸，离心，获取上清即为菌株的基因组DNA模板；[0058]2)以步骤1)中获得的基因组DNA为模板，分别使用各自相对应的特异性引物，进行PCR扩增，扩增条件如下：[0059]10μL反应体系：2×Premix Taq 5μL，10mmol/mL引物各0.4μL，模板DNA 0.5μL，然后加入无菌双蒸水或超纯水补足至10μL；[0060]PCR反应程序：95℃预变性5min；然后按95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸

[0055]

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1min，进行30个循环；72℃延伸10min；

[0061]3)将PCR扩增产物在1％的琼脂凝胶上电泳，用凝胶成像系统观察每个泳道出现的条带，记录扩增条带大小，获取每个菌株的特异性条带信息。[0062]具体地，通过本实施例的方法可得HPS的15种血清型菌株的特异性条带，结果如图1所示。

[0063]实施例3 HPS菌株的多重PCR血清分型方法

[00]本实施例通过如下方法进行HPS菌株的血清分型：

[0065]1)将15种血清型的HPS菌株分别在TSA培养基平板上划线，培养出单菌落，挑取单菌落，水浴煮沸，离心，获取上清即为菌株的基因组DNA模板；[0066]2)以步骤1)中获得的基因组DNA为模板，分别使用实施例1提供的6组引物，进行PCR扩增，扩增条件如下：[0067]10μL反应体系：2×Premix Taq 5μL，10mmol/mL引物各0.4μL，模板DNA 0.5μL，然后加入无菌双蒸水或超纯水补足至10μL；[0068]PCR反应程序：95℃预变性5min；然后按95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸10min；

[0069]3)将PCR扩增产物在1％的琼脂凝胶上150V电压下电泳20分钟，用凝胶成像系统观察每个泳道出现的条带，记录扩增条带大小，获取15种血清型的参考菌株条带信息。[0070]4)以步骤1)相同的方法获取待测菌株的基因组DNA模板，并重复步骤2)及步骤3)获取待测菌株的特异性条带信息，将其与步骤3)获得的参考菌株条带信息进行比对，判断待测菌株血清型。[0071]具体地，通过本实施例的方法可以得到HPS的15种血清型的参考菌株条带信息，结果如图2-图16所示，所得到的15种特异性条带之间通过条带的数量、位置以及大小得以明显区分。这其中需要说明的是，仅在G4泳道519bp处有特异性条带时，通过G6泳道532bp处是否有特异性条带来区分5型和12型血清型，其他情况下G6泳道不作为菌株血清型的鉴定依据。

[0072]在判断待测菌株血清型时，通过本实施例的方法可以精确，灵敏地鉴别HPS的15种血清型，特别是通过12型血清型特异性引物的设计，可以区分5型和12型菌株，同时本实施例仅使用6个PCR体系，简化了步骤，使用的试剂更少，效率更高。[0073]实施例4 HPS菌株血清分型实验

[0074]本实施例以实施例2提供的HPS菌株的多重PCR血清分型方法对武汉科前生物股份有限公司临床分离的74个HPS菌株进行血清分型，并同时使用常规的琼脂扩散(GD)法进行血清分型，并比对两种方法的分型结果，如下表所示：[0075]多重PCR分型结果与GD分型结果对比

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7/7页

[0077]

具体地，本发明提供的HPS多重PCR血清分型方法的分型结果和琼脂扩散法分型结

果一致，并且还鉴定出了琼脂扩散法没有鉴别的10个菌株(NT型)，其中9个是4型，1个是8型，这突显出本发明鉴定结果更加精确，鉴定范围更广，同时更加简便快捷，节约成本的特点。

[0079]最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

[0078]

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序　列　表

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序列表<110> 武汉科前生物股份有限公司<120> 副猪嗜血杆菌的血清分型方法、引物组合以及PCR体系<130> KHP191112254.6<160> 30<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 24<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1cgtgtcgtgt ctccagataa tact 24<210> 2<211> 25<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2cccgatatca gtatggttga acttg 25<210> 3<211> 25<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 3tatggagggt tttggtgaat tgtct 25<210> 4<211> 25<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 4aggattcttt tggcactgaa taagg 25<210> 5<211> 25<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 5caagaatatg gcatcttgaa aggca 25<210> 6<211> 25

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序　列　表

2/5页

<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 6cattggctaa cgccttacat ctatc 25<210> 7<211> 25<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 7cgttaagtca tttttccgtg tatcg 25<210> 8<211> 26<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 8caagattccc ccaatcatct gctaaa 26<210> 9<211> 26<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 9ggcttaggaa ttcagatgta tgggtt 26<210> 10<211> 25<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 10tattcagata atccatcagg gcacc 25<210> 11<211> 26<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 11gcttatcctc tgctagaaat gttgga 26<210> 12<211> 25<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 12

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序　列　表

3/5页

atagtatcct cttgacgtcg tttga 25<210> 13<211> 25<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 13ggtgttttga tatgttcagc tgtgt 25<210> 14<211> 26<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 14gctctgacat cccccttaaa ataaga 26<210> 15<211> 26<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 15tatggaaggg gattactact acctga 26<210> 16<211> 26<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 16ccctctccta atatccaact ttccat 26<210> 17<211> 26<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 17ggaagtggat attttggtat aggtgc 26<210> 18<211> 26<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 18gtaggaagag agtaatgagc atctcc 26<210> 19<211> 26

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序　列　表

4/5页

<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 19tatattgctt atacttggtc gcctgg 26<210> 20<211> 26<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 20gacgctaggt ttagcataat acttcc 26<210> 21<211> 26<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 21ggtgatgatg ttattgtcac ttctcg 26<210> 22<211> 26<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 22ggaaccctag aggatgttgc ttatta 26<210> 23<211> 25<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 23ggtcattttg gtaaaactgt ctgct 25<210> 24<211> 26<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 24ggttacgtct gcaaatgaga agattg 26<210> 25<211> 25<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 25

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序　列　表

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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图3

图4

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图5

图6

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图7

图8

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图10

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图11

图12

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图13

图14

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图15

图16

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