一种活体微生物固定化微球及其制备方法和应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 110106162 A(43)申请公布日 2019.08.09

(21)申请号 2019104257.5(22)申请日 2019.05.30(83)生物保藏信息

CGMCC NO：13930 2017.03.27

(71)申请人 华南农业大学

地址 5102 广东省广州市天河区五山路

483号(72)发明人 黄飞　李凯　颜玉坚　王泽煌　

王衡　(74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有

限公司 44245

代理人 崔红丽(51)Int.Cl.

C12N 11/04(2006.01)C02F 3/34(2006.01)

(54)发明名称

一种活体微生物固定化微球及其制备方法和应用(57)摘要

本发明公开一种活体微生物固定化微球及其制备方法和应用。该方法包括微生物固定化载体、菌液悬浮定殖、微生物活性颗粒和增殖再培养等步骤。本发明的微球呈球状，内部有孔隙，直径3.0～4.0mm，比重1.10～1.20g/cm3，弱碱性，具备良好的沉降性能和机械强度。该微球不但能发挥载体对镉的化学吸附作用，还能改善活性微生物的生长繁殖环境，从而提高活性细菌对镉的胞外吸附和胞内积累作用。在初始Cd2+浓度250mg/L以下范围内，最大吸附-积累量可达158.77mg/g。本发明具备原材料廉价易得、工艺可操作性强、微球产品环保且易回收、治理效果

在重金属污染水体的生物治理过程显著等优点，

中有广阔的应用前景。

C12R 1/085(2006.01)C02F 101/20(2006.01)

权利要求书2页 说明书6页 附图6页

CN 110106162 ACN 110106162 A

权　利　要　求　书

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1.一种活体微生物固定化微球的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)微生物固定化载体：水稻秸秆经过干燥、粉碎和过筛后，限氧热解、冷却并研磨过筛，得到微生物固定化载体；

(2)菌液悬浮定殖：将蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)RC-1活化，获得细胞悬液；取5～20mL细菌悬液和0.2～1.5g微生物固定化载体混合，振荡培养1～2h，制成混合浆液A；

(3)微生物活性颗粒：将灭菌的质量分数2％～6％的海藻酸钠溶液添加至混合浆液A中，获得混合浆液B；然后将混合浆液B滴入到灭菌的CaCl2溶液中，固化2～10h，形成微生物活性颗粒；其中，微生物固定化载体在混合浆液B中的用量为0.2～1.5g/100mL；

(4)增殖再培养：将步骤(3)得到的微生物活性颗粒于新鲜牛肉膏蛋白胨液体培养基增殖再培养1～4h，用无菌水浸泡处理表面后，得到活体微生物固定化微球；

所述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)RC-1，于2017年03月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO：13930。

2.根据权利要求1所述的活体微生物固定化微球的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的微生物固定化载体的制备方法，包括如下步骤：水稻秸秆经过自然风干和剪碎研磨后，放置于热解炉中300～700℃下限氧热解2～4h，冷却并研磨过筛60～100目，得到微生物固定化载体。

3.根据权利要求1所述的活体微生物固定化微球的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的细胞悬液的OD600＝1.2～1.5；步骤(3)中所述的滴入的速度为5～10mL/min；

步骤(3)中所述的CaCl2溶液为质量分数为2～10％的CaCl2溶液；步骤(3)中所述的固化的时间为2～5h。

4.根据权利要求3所述的活体微生物固定化微球的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的细菌悬液的用量为5mL；步骤(2)中所述的振荡培养的时间为2h；

步骤(3)中所述的海藻酸钠溶液的质量分数为4％；步骤(3)中所述的滴入的速度为7mL/min；

步骤(3)中所述的CaCl2溶液为质量分数为5％的CaCl2溶液；

步骤(3)中所述的微生物固定化载体在混合浆液B中的用量为1.5g/100mL；步骤(3)中所述的固化的时间为2h；

步骤(4)中所述的增殖再培养的时间为4h。5.根据权利要求1、2、3或4所述的活体微生物固定化微球的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方为：10g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏，5g/L NaCl2，pH值为7.0±0.2。

6.一种活体微生物固定化微球，其特征在于：通过权利要求1～5任一项所述的制备方法制备得到。

7.根据权利要求6所述的活体微生物固定化微球，其特征在于：所述的活体微生物固定化微球呈球状，内部有孔隙，直径3.0～4.0mm，比重1.10～1.20g/cm3，弱碱性；

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所述的弱碱性的pH范围为7.66～8.76。

8.权利要求6或7所述的活体微生物固定化微球在用于重金属污染的治理中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

所述的活体微生物固定化微球在水体重金属污染治理中的应用。10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述的重金属为镉。

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一种活体微生物固定化微球及其制备方法和应用

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技术领域

[0001]本发明属于环境污染微生物治理技术领域，涉及一种活体微生物固定化微球及其制备方法和应用，具体涉及一种具有重金属镉抗性的活性细菌固定化方法，以及固定化菌球在废水生物处理中的应用。

背景技术

[0002]重金属镉具有很强的生物毒性且不易被生物降解，在环境中可以通过食物链进入人体器官，导致致畸、致癌、致突变等作用，严重威胁人体健康。针对水体重金属镉污染，主要有物理化学法和生物法，包括化学沉淀、离子交换、膜分离、吸附分离、植物吸收和微生物吸附积累等。目前，微生物固定化方法，作为水体重金属污染治理的新技术之一，主要特征是利用化学或物理方法将游离的功能微生物固定到载体上，通过活性微生物的吸附-积累作用来提高处理效果。其中，保持微生物的活性是该技术在废水治理应用中的关键。

[0003]生物炭是生物质(如植物秸秆和动物粪便等)在完全或部分缺氧条件下热解产生的一类高度稳定的碳质材料。它可以为微生物提供栖息与繁殖的场所，还可能提供营养物质来促进微生物的生长繁殖。在我国，稻秆原材料来源丰富，每年平均产生约300百万吨，而且稻秆生物炭被认为是一种高效的重金属吸附剂。因此，稻秆生物炭可作为一种理想的微生物固定化载体，它不但能通过自身吸附作用减少水体中重金属浓度来保护微生物，而且能提供良好的栖息环境来促进微生物生长繁殖，以便微生物通过吸附-积累作用降低重金属污染程度。目前已报道的生物炭固定化微生物技术在水体重金属污染治理方面，处理效果不佳，主要是因为在废水处理过程中大部分微生物丧失了活性，难以发挥吸附-积累的作用。

[0004]常见的固定化方法有吸附法、包埋法、交联法和共价结合法，其中吸附法具备操作简单、成本低、对细胞活性影响小等优点，但缺点是载体与微生物结合力较低，效果不稳定。因此，研发一种制备简单、环境有好型的、效果良好的活体微生物固定化产品，在水体重金属污染治理方面具有广泛的应用前景。

发明内容

[0005]为了克服现有技术中活体微生物固定化技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种活体微生物固定化微球的制备方法。通过该方法可维持微生物具有较高活性。[0006]本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的活体微生物固定化微球。

[0007]本发明的再一目的在于提供上述活体微生物固定化微球的应用。[0008]本发明的目的通过下述技术方案实现：[0009]一种活体微生物固定化微球的制备方法，包括如下步骤：[0010](1)微生物固定化载体：水稻秸秆经过干燥、粉碎和过筛后，限氧热解、冷却并研磨过筛，得到微生物固定化载体；

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(2)菌液悬浮定殖：将蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)RC-1活化，获得细胞悬液；

取5～20mL细菌悬液和0.2～1.5g微生物固定化载体混合，振荡培养1～2h，制成混合浆液A；[0012](3)微生物活性颗粒：将灭菌的质量分数2％～6％的海藻酸钠溶液添加至混合浆液A中，获得混合浆液B；然后将混合浆液B滴入到灭菌的CaCl2溶液中，固化2～10h，形成微生物活性颗粒；其中，微生物固定化载体在混合浆液B中的用量为0.2～1.5g/100mL；[0013](4)增殖再培养：将步骤(3)得到的微生物活性颗粒于新鲜牛肉膏蛋白胨液体培养基增殖再培养1～4h，用无菌水浸泡处理表面后，得到活体微生物固定化微球。[0014]优选的，步骤(1)中所述的微生物固定化载体的制备方法，包括如下步骤：水稻秸秆经过自然风干和剪碎研磨后，放置于热解炉中300～700℃下限氧热解2～4h，冷却并研磨过筛60～100目，得到微生物固定化载体；[0015]更优选的，步骤(1)中所述的所述的微生物固定化载体的制备方法，包括如下步骤：水稻秸秆经过自然风干和剪碎研磨后，放置于先通入20min氮气的热解炉中700℃下限氧热解2h，冷却并研磨过筛100目，得到微生物固定化载体；[0016]所述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)RC-1，是通过从镉污染土壤(1.4Cdmg/kg)中分离筛选获得，其形态特征为：杆状、成对或链状排列，芽孢中生或偏端生、椭圆形或桩形、无伴孢晶体，菌落圆形乳白色、表面粗糙，属革兰氏染色阳性。所述菌株RC-1可应用于水体重金属镉污染治理中。

[0017]所述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)RC-1的保藏信息如下：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期：2017年03月27日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO：13930。[0018]优选的，步骤(2)中所述的细胞悬液的OD600＝1.2～1.5，即对数增长期细胞悬液；[0019]优选的，步骤(2)中所述的细菌悬液的用量为5mL；[0020]优选的，步骤(2)中所述的振荡培养的时间为2h；[0021]优选的，步骤(3)中所述的海藻酸钠溶液的质量分数为4％；[0022]优选的，步骤(3)中所述的滴入的速度为5～10mL/min；更优选为7mL/min；[0023]优选的，步骤(3)中所述的CaCl2溶液为质量分数为2～10％的CaCl2溶液；更优选为质量分数为5％的CaCl2溶液。[0024]优选的，步骤(3)中所述的微生物固定化载体在混合浆液B中的用量为1.5g/100mL；

[0025]优选的，步骤(3)中所述的固化的时间为2～5h；更优选为2h；[0026]优选的，步骤(4)中所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方为：10g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏，5g/L NaCl2，pH值为7.0±0.2；[0027]优选的，步骤(4)中所述的增殖再培养的时间为4h；[0028]一种活体微生物固定化微球，通过上述制备方法制备得到。[0029]所述的活体微生物固定化微球呈球状，内部有孔隙，直径3.0～4.0mm，比重1.10～1.20g/cm3，弱碱性，具备良好的沉降性能和机械强度。[0030]所述的弱碱性的pH范围为7.66～8.76。

[0031]所述的活体微生物固定化微球在用于重金属污染的治理中的应用；[0032]进一步，所述的活体微生物固定化微球在水体重金属污染治理中的应用。

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优选的，所述的重金属为镉(Cd)。

[0034]具体包括如下步骤：

[0035]在含有初始浓度250mg/L以下Cd2+的牛肉膏蛋白胨液体培养基(pH为7.0±0.2)中，加入固液比为0.2g/L的上述活体微生物固定化微球，振荡培养，实现对Cd2+的吸附。[0036]优选的，所述的Cd2+的初始浓度为5～250mg/L；进一步优选为100～220mg/L；再进一步优选为110～200mg/L；更优选为150～180mg/L；最优选为180mg/L。[0037]所述的振荡培养的条件为28±2℃，90～150r/min振荡培养5～30h；优选为28±2℃，150r/min振荡培养5～30h；进一步的，培养时间为16～30h；再进一步的，培养时间为19～26h；更优选的，培养时间为19～26h；最优选的，培养时间为22～24h。[0038]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：[0039](1)本发明制得的活体微生物固定化微球兼具生物炭载体的被动吸附和活性微生物的主动吸附-积累作用，处理效果显著。固定化微球在pH为7.0±0.2、温度28±2℃，150r/min振荡培养24h，对初始Cd2+浓度为180mg/L的吸附量高达158.77mg/g。[0040](2)本发明制得的活体微生物固定化微球在保持了较高吸附能力的同时，具有废弃物资源化、环保安全、易于回收、微生物活性高等优点，可广泛应用于重金属污染水体和土壤的生物治理。[0041](3)本发明制得的活体微生物固定化微球不但能发挥微生物固定化载体对镉的化学吸附作用，还能改善活性微生物的生长繁殖环境，从而提高活性细菌对镉的胞外吸附和胞内积累作用。在初始Cd2+浓度250mg/L以下范围内，最大吸附-积累量可达158.77mg/g。本发明具备原材料廉价易得、工艺可操作性强、微球产品环保且易回收、治理效果显著等优点，在重金属污染水体的生物治理过程中有广阔的应用前景。附图说明

[0042]图1是本发明方法实施例1中活体微生物固定化微球的制备流程实物示意图。[0043]图2是实施例1的固定化微球产品的扫描电镜图。

[0044]图3是实施例2中不同初始pH对固定化微球吸附-积累量的影响；其中，稻杆微球是指实施例1制得的活体微生物固定化微球；鸡粪微球是指以鸡粪为载体材料参照实施例1的制备方法制备得到的固定化微球；污泥微球是指以污泥为载体材料参照实施例1的制备方法制备得到的固定化微球。

[0045]图4是实施例3中不同初始Cd2+浓度对固定化微球吸附-积累量(a)、细菌数量(b)和ATP酶活(c)的影响。

[0046]图5是实施例4中细胞代谢抑制剂DCC下不同初始Cd2+浓度对固定化微球吸附-积累量的影响。

[0047]图6是实施例5中反应时间对固定化微球吸附-积累量的影响；其中，a：20mg/L Cd2+，b：50mg/L Cd2+，c：100mg/L Cd2+。

[0048]图7是实施例6中不同机制对活体微生物固定化微球吸附-积累量的贡献。具体实施方式

[0049]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限

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于此。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。[0050]实施例1固定化微球制备流程与材料形貌及性质[0051]参见图1，微球产品制备步骤如下：[0052]第一步，水稻秸秆经过自然风干和剪碎研磨后，放置于事先通入氮气20分钟的热解炉中，在温度700℃下限氧热解2h，冷却至室温后研磨过筛100目，得到微生物固定化载体。[0053]第二步，将蜡样芽孢杆菌RC-1挑菌1～2环接种于牛肉膏蛋白胨体液体培养基中，在30℃，150r/min下培养活化8～10h后(OD600＝1.2～1.5)，获得细胞悬液；取5mL细胞悬液与1.5g微生物固定化载体混合，振荡培养2h，制成混合浆液A；将灭菌的质量分数4％的海藻酸钠溶液添加至混合浆液A中至100mL，获得混合浆液B。[0054]第三步，将第二步所得的混合浆液B通过蠕动泵以7mL/min速度滴入含质量分数为5％的CaCl2溶液中，固化2h后形成微生物活性颗粒。[0055]第四步，将微生物活性颗粒接入新鲜牛肉膏蛋白胨液体培养基增殖再培养4h，用无菌水浸泡处理表面后，得到活体微生物固定化微球。

[0056]本实施例制备活体微生物固定化微球的制备流程实物示意图如图1所示，微球颗粒呈球状，内部有孔隙，直径3.0～4.0mm，比重1.10～1.20g/cm3，弱碱性，具备良好的沉降性能和机械强度(99％±1％)。[0057]其中，机械强度测定方法：固定化菌球100颗和50mL去离子水放入100mL锥形瓶，以300r/min振荡，48h后观察菌球完整的个数，并计算完好的菌球个数占原菌球总数的比率，表示固定化微球的强度系数。

[0058]本实施例制得的活体微生物固定化微球的扫描电镜图如图2所示，微生物固定化载体的孔隙内部和表面负载大量微生物。[0059]实施例2 pH对固定化微球吸附-积累量的影响[0060]当初始Cd2+浓度为100mg/L条件下，针对三种不同原材料制备的微生物固定化载体(稻秆、鸡粪和污泥)，取固液比为0.2g/L的固定化微球在不同pH(2、3、4、5、6和7)的牛肉膏蛋白胨液体培养基(pH为7.0±0.2)中，常温下150r/min摇速振荡培养24h后，离心取上清液(10000rpm，15min)测定Cd2+浓度。[0061]从图3可以看出，随着初始pH在2～5变化范围时，三种固定化微球的吸附-积累量均快速增加，然后逐渐变缓，最终达到平衡。当初始pH为5～7范围时，固定化微球的吸附-积累量范围为91.84～124.05mg/g，尤其在pH＝7时，最大吸附-积累量分别为：稻秆生物炭固定化微球(124.05mg/g)>鸡粪生物炭固定化微球(107.67mg/g)>污泥生物炭固定化微球(95.37mg/g)。另外，该pH对于活菌的生长繁殖也是非常有利的。[0062]本实施例说明，稻秆生物炭固定化微球对水体Cd2+吸附-积累能力最佳，为其在不同pH环境条件下的应用提供了保证。

[0063]实施例3初始Cd2+浓度对固定化微球吸附-积累量、微生物数量和ATP酶活的影响。[00]在不同初始Cd2+浓度(5、10、20、50、80、100、110、120、150、180、200、210、220、250mg/L)的牛肉膏蛋白胨液体培养基(pH为7.0±0.2)中，加入固液比为0.2g/L的实施例1制备的活体微生物固定化微球，常温下匀速振荡培养24h后(150r/min)，离心取上清液(10000rpm，15min)测定Cd2+浓度。另外，将分离出来的固定化微球置于20mL缓冲溶液

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(0.05mol/L Na2CO3和0.02mol/L柠檬酸)，振荡培养1h，待微球完全溶解后，进行微生物平板计数和ATP酶活测定。

[0065]从图4a可以看出，随着初始Cd2+浓度的增大，固定化微球的吸附-积累量快速增加；当Cd2+浓度大于110mg/L时，吸附-积累量逐渐变缓并趋于平衡，尤其是Cd2+浓度为180mg/L时，最大值为158.77mg/g；当初始Cd2+浓度大于200mg/L时，吸附-积累量逐渐下降，即使初始Cd2+上升至250mg/L时，吸附积累量也维持较高值123.62mg/g。与此同时，图4b显示初始Cd2+浓度对细菌数量的影响，随着Cd2+浓度的增大(10～250mg/L)，微生物数量从2.5×1012CFU/mL下降至2.8×107CFU/mL。同样地，图4c表明初始Cd2+浓度对细菌活性的影响，随着Cd2+浓度的增大(0～250mg/L)，细菌ATP酶活性从11.53U/mgprot下降至1.35U/mgprot。这些表明随着初始Cd2+浓度的增加，细菌的数目和活性受到显著影响，但即使初始Cd2+浓度最大时(250mg/L)，微生物依然保持一定程度的活性，从而提高处理效果。[0066]本实施例说明在不同初始Cd2+浓度条件下，固定化微球的吸附-积累量均较高，为其在实际应用中提供了良好的基础和保证。

[0067]实施例4细胞ATP酶抑制剂DCC(二环己基碳二亚胺)下不同初始Cd2+浓度对固定化微球吸附-积累量的影响。

[0068]在抑制剂DCC(1mmol/L)条件下，不同初始Cd2+浓度(5、10、20、50、80、100、110、120、150、180、200、210、220、250mg/L)的牛肉膏蛋白胨液体培养基(pH为7.0±0.2)中，加入固液比为0.2g/L的实施例1制备的活体微生物固定化微球，常温下匀速振荡培养24h后，离心取上清液测定Cd2+浓度。[0069]从图5可以看出，即使在细胞代谢抑制剂DCC存在的条件下，随Cd2+浓度的增大，吸附-积累量仍然不断增加，然后逐渐达到平衡，当初始Cd2+浓度大于180mg/L时，吸附-积累量随之减少。在初始Cd2+浓度为150mg/L时，最大吸附-积累量为131.43mg/g。这表明生物炭载体能有效地保护细菌的活性，而且在初始Cd2+浓度在100～180mg/L范围内，固定化微球的吸附-积累量仍然较高，维持在113.02～131.43mg/g范围。[0070]本实施例说明，即使在细胞代谢抑制剂下，固定化微球对Cd2+仍具有较高的吸附-积累量，为其在不利环境条件中的应用提供了保证。

[0071]实施例5反应时间对固定化微球吸附-积累量的影响。[0072]在含有20、50和100mg/L Cd2+的牛肉膏蛋白胨液体培养基(pH为7.0±0.2)中，加入固液比为0.2g/L的实施例1制备的活体微生物固定化微球，不同时间内(0、1、2、3、5、7、10、13、16、19、22、26、30h)进行离心取上清液，并测定其中Cd2+浓度。[0073]图6a可以看出，当初始Cd2+浓度为20mg/L时，随反应时间的增加，固定化微球的吸附-积累量不断增加，在22h时趋于平衡，最大吸附-积累量为30.51mg/g。图6b表明，当初始Cd2+浓度为50mg/L条件下，随着反应时间16h内，固定化微球的吸附-积累量逐渐增加，当反应时间在16～22h范围内，吸附-积累量快速增加，当反应时间22h后达到平衡，最大吸附-积累量为81.66mg/g。图6c显示，在初始Cd2+浓度为100mg/L时，吸附-积累量随时间的增加而快速增加，在反应时间22h时达到平衡，最大吸附-积累量为141.37mg/g。[0074]本实施例说明，不同浓度条件下固定化微球对Cd2+的吸附-积累平衡时间均较短，吸附-积累量也较高，为其快速治理水体重金属污染提供了技术保证。[0075]实施例6

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在初始Cd2+浓度为20、50和100mg/L的牛肉膏蛋白胨液体培养基(pH为7.0±0.2)

中，加入固液比为0.2g/L的实施例1制备的活体微生物固定化微球，匀速振荡培养24h后，离心取上清液测定Cd2+浓度，计算出总吸附-积累量Q。弃去上清液，加入等量的ddH2O，振荡培养2h，离心并测定上清液中Cd2+浓度，所得Q1即为静电引力作用所贡献的吸附-积累量，相应的贡献比例为Q1/Q。弃去上清液，加入等量的1.0mol/L NH4NO3溶液，振荡培养2h，测定上清液中Cd2+浓度得到Q2，即为离子交换机制贡献的吸附-积累量，贡献比例为Q2/Q。然后再次弃去上清液，加入等量的0.1mol/L EDTA-Na2溶液，振荡培养2h后测定上清液中Cd2+浓度Q3，即为官能团螯合作用所贡献的吸附-积累量，贡献比例为Q3/Q。与此同时，对离心管中沉淀物进行消解测定Cd2+浓度Q4，Q4即为细胞内部积累贡献的吸附-积累量，贡献比例为Q4/Q。最后，总吸附-积累量Q减去以上四种机制的吸附-积累量后得到Q5，即为沉淀机制贡献的吸附-积累量，贡献比例为Q5/Q。[0077]图7可以看出，三种不同初始Cd2+浓度条件下，离子交换作用是固定化微球吸附-积累的主要作用机制，螯合机制次之。尤其注意的是，活体细胞内部Cd积累量(Q4)在三种初始浓度下分别为1.2、6.7和6.3mg/g，分别占微球总吸附-积累量的3.7％、8.2％和5.3％，这表明固定化技术能有效地保持功能微生物的活性，发挥细胞外部的主动吸附和内部积累作用。

[0078]本实施例说明，活体微生物固定化微球既能发挥微生物载体的化学吸附作用，又能提高活体微生物的吸附-积累作用，共同为有效治理水体重金属污染提供技术保障。[0079]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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