水杨酸诱导不结球白菜抗黑斑病机制的探讨

南京农业大学学报摇2009,32(4):2327JournalofNanjingAgriculturalUniversity

http://nauxb郾njau郾edu郾cn

王利英,侯喜林,陈晓峰.水杨酸诱导不结球白菜抗黑斑病机制的探讨[J].南京农业大学学报,2009,32(4):2327

水杨酸诱导不结球白菜抗黑斑病机制的探讨

(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,江苏南京210095)

摘要:以不结球白菜感黑斑病品种短白梗为材料,于两叶一心期用0郾5mmol·L-1水杨酸(SA)进行叶面喷雾处理,用半定量RT鄄PCR技术检测叶片中Bcchi、BcPR4、BcAF基因的表达变化,并在SA处理后24h接种甘蓝链格孢菌(Alterna鄄riabrassicicola),研究抗病相关物质的变化,以探讨SA诱导的抗病机制。结果表明,SA喷雾处理后显著诱导了BcAF、BcPR4、Bcchi在短白梗中的表达;接种后,经SA处理的短白梗中,48h前SOD活性、12h后POD活性、48h前PPO活性和0~12h与84h后H2O2含量均高于未经处理的,而CAT活性在处理36h后低于未经处理的。用SA对短白梗进行喷雾处理可明显降低其病情指数,表明SA诱导系统获得性抗性在提高黑斑病抗性方面起到重要作用。关键词:不结球白菜;黑斑病;水杨酸;抗病相关物质

中图分类号:S634郾3摇摇摇文献标志码:A摇摇摇文章编号:10002030(2009)04002305

王利英,侯喜林*,陈晓峰

Studyonthemechanismofinducedresistancetoblackspotdisease

bySAinnon鄄headingChinesecabbage

(StateKeyLaboratoryofCropGeneticsandGermplasmEnhancement,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

WANGLi鄄ying,HOUXi鄄lin*,CHENXiao鄄feng

Abstract:0郾5mmol·L-1SAwasusedtosprayleavesofDuanbaigengwhichissusceptibletoblackspotdiseaseattwo鄄leavesandoneheartstage,andsemi鄄quantitativeRT鄄PCRwasdonetodetecttheexpressionofBcchi,BcPR4,BcAFinleaves.Alternariabrassicicolawasinoculated24hafterSAtreatmentinordertostudythechangesofresistance鄄relatedmaterialstoknowbetteroftheenhancedbySAinDuanbaigeng.Afterinoculation,theactivitiesofSOD(0

48),POD(12hlater),PPO(0

resistantmechanismofSAinduction.TheresultsshowedtheexpressionofBcchi,BcAFandBcPR4wassignificantlyinducedandthecontentofH2O2(012hand84hlater)wereallhigherthanthoseunprocessedbySAinDuanbaigeng.However,CATac鄄tivewaslowerthanthatunprocessedafter36h鄄treatment.SAcanreducethediseaseindexwhichindicatesthatsystematicallyac鄄quiredresistanceinducedbySAplaysanimportantroleintheresistancetoAlternariabrassicicolainnon鄄headingChinesecabbage.Keywords:non鄄headingChinesecabbage;blackspotdisease;SA;resistant鄄relatedmaterials

48h)and

纪40年代,十字花科蔬菜黑斑病在中国分布较普遍,但对生产影响不大,自70代年以来,十字花科黑斑病在我国云南、贵州、陕西及北京等地迅速蔓延,造成重大损失,成为主要病害之一[2-3]。在我国南方地区,十字花科黑斑病主要由甘蓝链格孢菌(Alternariabrassicicola)引起。目前国内外对其防治的方法主要采用药物防治,农药的大量使用往往影响蔬菜的品质,因此寻找提高不结球白菜对黑斑病抗性的方法成为目前重要的课题。

水杨酸(SA)是植物体内自身合成的一种类似植物激素的酚类化合物,能诱导一些防御基因的表达,激活植物过敏反应(hypersensitiveresponse,HR)和系统获得性抗性(systemicacquiredresistance,SAR)[4]。云兴福等[5]在黄瓜幼苗子叶期及第一真叶期用SA处理,在自然病原激发试验和人工接种病细菌、病毒的抗性。但外源SA诱导不结球白菜抗黑斑病的作用未见报道。

本文通过研究外源SA对感病后不结球白菜病程相关蛋白基因BcAF(植物防卫素)、BcPR4(病程相关蛋白4)、Bcchi(几丁质酶)及抗病相关物质的影响,以探讨SA诱导的抗病机制。

收稿日期:20080429

基金项目:国家科技支撑计划项目(2006BAD01A7-1-11)

作者简介:王利英,硕士研究生。*通讯作者:侯喜林,教授,主要从事蔬菜遗传育种与分子生物学研究,E鄄mail:hxl@njau郾edu郾cn。

十字花科蔬菜黑斑病是由真菌引起的一种世界性重要病害,最早于1836年在甘蓝上发现[1]。20世

原激发病害试验中,植株相对抗病效果均有所提高。大量研究表明,外源SA可诱导多种植物对真菌、

24摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇南摇京摇农摇业摇大摇学摇学摇报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第32卷

1摇材料与方法

1郾1摇材料

摇摇田间采集感黑斑病不结球白菜叶片,参照方中达[6]的方法进行病原菌分离和纯化,所得纯菌株进行苛赫史密斯(Koch鄄Smith)原理验证,并在显微镜下进行形态学鉴定。不结球白菜感病品种短白梗1郾2摇不结球白菜培养和处理由南京农业大学白菜课题组提供。

不结球白菜种子经0郾1g·L-1HgCl2灭菌后播种于装有灭菌基质的穴盘中,在人工气候箱25益、

光周期12h/12h下培养,待长至两叶一心期进行以下试验。

叶片0郾1g,保存于-70益冰柜,用于检测短白梗中Bcchi、BcPR4、BcAF基因的表达变化。

1)0郾5mmol·L-1水杨酸叶面喷雾处理。于处理后0、6、12、24、36、48和72h分别取相同叶位2)血球计数法配制浓度为1郾0伊105mL-1的孢子悬浮液,均匀喷洒在叶片上,以叶片湿而不滴为宜。

接种后在25益黑暗保湿24h后正常管理。幼苗在接种处理前24h用0郾5mmol·L-1水杨酸叶面喷雾1片0郾1g,保存于-70益冰柜中待测,每个处理设3次重复。

次,接种对照同时喷等量清水。于接种后0、6、12、24、36、48、72、96和108h分别取相同叶位叶

3)用0郾5mmol·L-1水杨酸叶面喷雾处理短白梗,对照喷等量清水,24h后将1郾0伊105mL-1孢子悬

4天开始夜间保湿,白天揭开给以光照,第8天保湿24h后调查材料发病情况[3]。

浮液均匀喷洒在叶面上,以叶片湿而不滴为宜。接种后在25益黑暗保湿24h,然后正常管理3d,从第

1郾3摇病情指数分级标准[7]

0级:无病;1级:接种叶生褐色小点,无褪绿斑;3级:接种叶生3mm以下的褪绿斑,无霉层;5级:接种叶生3mm以上的褪绿斑,有较少霉层,病斑不连成片;7级:接种叶生3mm以上的褪绿1郾4摇生理指标测定

斑,有较多霉层,病斑连成片;9级:接种叶病斑连成片,且大面积枯死,霉层明显。

SOD活性测定采用NBT法[8];PPO活性测定参照汤章城[9]的方法;POD活性测定采用愈创木酚

法[10];CAT活性测定采用分光光度计法[8],以每克每分钟D240值变化0郾01为1个酶活性单位(U)。3000g离心10min。取1mL提取液,加20%TiCl4浓HCl溶液0郾1mL,浓氨水0郾2mL,3000g离心10min,沉淀用丙酮悬浮洗涤5次后溶于3mL1mol·L-1H2SO4中,测定A410值。1郾5摇cDNA的合成

数据统计分析采用DPS数据处理系统。

H2O2含量的测定参照商明清等[11]的方法,略有改动。取0郾1g叶片用预冷丙酮1郾6mL研磨成匀浆,

总RNA的提取按照南京博飞科技有限公司的SimplyPRNAExtractionKit试剂盒说明书进行。根据检测结果调整RNA用量进行反转录。反应体系:5伊RTBuffer4滋L,RibonucleaseInhibitor0郾5滋L,Re鄄应体系。

verseTranscriptaseXL(AMV)1滋L,dNTPMixture1滋L,OligDT2滋L,用DEPC水调至20滋L的RT反1郾6摇半定量RT鄄PCR引物设计

摇摇试验设计引物4对,不结球白菜3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内标基因。病程相关蛋白基因BcAF、BcPR4和Bcchi引物见1郾7摇目的基因的半定量RT鄄PCR扩增(TaKaRa公司),反应体系总体积25滋L:5伊RTBuffer2郾5滋L,25mmol·L-1MgCl21郾5引物各1滋L,5U·滋L-1TaqDNA聚合酶0郾25

半定量RT鄄PCR扩增使用TaqDNA聚合酶表1。

表1摇半定量RT鄄PCR特异引物

Table1摇Specificprimerforsemi鄄quantitativeRT鄄PCR

基因GeneBcAFBcPR4BcchiGAPDH

登录号

Accessionnumber

AB302324AB325873AB302323AB367451

特异引物Specificprimer

F:5忆鄄TCCATCATCACCCTTCTC鄄3忆R:5忆鄄ATCCATGTTGTGCTCCTT鄄3忆

F:5忆鄄CGTGGTCGTGATTCTTGCGGTA鄄3忆R:5忆鄄CGTGGTCGTGATTCTTGCGGTA鄄3忆F:5忆鄄CTACACCCGTGATTCTTTC鄄3忆R:5忆鄄GCTCCGTTTATTTCTTCTT鄄3忆F:5忆鄄CCACTAACTGCCTTGCTCCAC鄄3忆R:5忆鄄GCTTGCCCTCAGATTCCTCCT鄄3忆

滋L,2郾5mmol·L-1dNTPs1郾5滋L,上、下游

第4期摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇王利英,等:水杨酸诱导不结球白菜抗黑斑病机制的探讨25

30s,50益30s,72益30s,30个循环;72益延伸10min。取5滋LRT鄄PCR产物于1郾5%琼脂糖凝胶上电泳分析。

滋L,ddH2O和cDNA17郾25滋L,其中cDNA模板的数量通过内标调整。扩增条件:95益3min;95益

2摇结果与分析

2郾1摇水杨酸对病情指数的影响

摇摇本试验中,经SA处理的短白梗幼苗病情指数为14郾29,清水对照的病情指数为60郾94,说明SA可提高不结球白菜对A郾brassicicola的抗性。

如图1

2郾2摇SA对不结球白菜SOD、POD、PPO、CAT活性和H2O2含量的影响

A所示,接种A郾brassicicola后0~24h,两处理中SOD活性均呈下降趋势,经SA处理的短

白梗中SOD活性相对较高,24h后两处理中SOD活性均升高,并在接种后36h和72h出现2个峰值。未经SA处理的短白梗叶片中的SOD活性48h后明显高于SA处理。

经SA处理和未经SA处理的短白梗接种A郾brassicicola后,叶片中的POD活性均表现为先下降后升高的趋势,经SA处理的短白梗POD活性始终高于未经SA处理的,且出现的峰值早,持续的时间长(图1梗(图1

B)。经SA处理的不结球白菜短白梗的PPO活性在接种后0~48h始终高于未经SA处理的短白

C)。

D可见,在整个过程中,经SA处理的短白梗接种A郾brassicicola后,除12~24h外,其

CAT活性显著低于未经SA处理的,且第1个CAT峰值也滞后于未经SA处理的,在接种后72h两者同时达到第2个峰值,108h时两者的CAT活性均恢复到接种前水平。

如图1

SA处理的。12h后,H2O2在两处理中的含量均明显升高,经SA处理的短白梗中H2O2含量低于未经SA处理的。

E所示,A郾brassicicola处理后0~12h,SA诱导处理的短白梗叶片中H2O2含量远高于未经

从图1

图1摇接种Alternariabrassicicola后SOD(A)、POD(B)、PPO(C)、CAT(D)活性Fig郾1摇ChangesofSOD(A),POD(B),PPO(C),CAT(D)activitiesandH2O2content(E)

infectedwithAlternariabrassicicola

和H2O2含量(E)的变化

26摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇南摇京摇农摇业摇大摇学摇学摇报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第32卷

2郾3摇SA对病程相关蛋白基因的诱导作用

摇摇植物防卫素、几丁质酶和PR4被认为是重要的抗真菌病程相关蛋白。从图2中可以看出,经SA处理后12hBcAF开始表达,并在长时间内保BcPR4均在处理后6h开始大量表达,在12h达到最高水平,随后逐渐下降,BcPR4在处理后48h已不再表达,Bcchi在处理后72h仍有微弱表达。持较高水平,在72h降至微弱表达。Bcchi、

3摇讨论

水杨酸是广泛存在于植物界的一种小分子酚类

图2摇SA处理后短白梗中BcAF、Bcchi、BcPR4的变化Fig郾2摇ChangesofBcAF,Bcchi,BcPR4aftertreatedwith

SAofDuanbaigeng

物质,不仅可以调节植物的某些生长发育过程,还能诱导植物产生抗逆性,抵抗不良因素造成的伤害。许多研究认为SA能通过诱导植物体中病程相关蛋白(PR)基因的表达,提高植物的抗病性。病原菌侵染植物后产生的一些PR如PR1、PR2和PR

同时,会使整株产生系统抗性,如果采用抑制剂抑制PRs活性,植株抗病力会下降,但外施SA则可以恢复其抗病性。几丁质酶、PR4、植物防卫素是植物中重要的病程相关蛋白。几丁质酶具有降解病原菌细胞壁的功能,能对抗病原菌的侵染,抑制真菌生长增殖,转几丁质酶基因植物连续表达后能减低真菌的危害[13-15]。PR4蛋白具有几丁质酶特性,具备潜在的抵抗病原菌侵染的能力[16],植物防卫素家族也被证实对真菌具有广谱抗性,能抑制真菌的萌发。本研究中,SA处理显著诱导了短白梗中几丁质酶基因Bcchi、BcPR4、植物防卫素基因BcAF3个病程相关基因的表达,从而抵抗甘蓝链格孢菌的侵染,起到抗黑斑病的作用。

在植物抗病研究中发现SA及其类似物可提高SOD、POD等保护酶活性,降低膜脂氧化水平[17]。

3等均可被外源SA诱导[12]。各种PR基因表达的

POD、PPO是木质素合成或氧化的关键酶,细胞壁木质化加强可以提高细胞壁抗真菌穿透、抗酶溶解能力,又可以真菌酶和毒素从真菌向寄主扩散[18]。黄清泉等[19]的研究表明,用1郾0mmol·L-1的SA处理黄瓜幼苗24h后,叶片中POD活性剧增。本研究中,经SA处理的短白梗中POD活性始终高于未经SA处理的,这与前人在辣椒、花生、棉花、水稻等植物上施用SA后报道的结果相似[20-24]。SOD能催化

种处理后0~36h,经SA处理的短白梗SOD活性较未经SA处理的高,说明SA可以提高不结球白菜叶片中SOD的活性,从而提高其抗病性;36h后,未经SA处理的SOD活性较高,则可能是植物体内高浓度的活性氧诱导SOD相关基因表达的结果。

歧化反应生成O2和H2O2,其活性的高低被认为是植物抗逆境伤害的重要指标。本研究中,接

也可作为第二信使激活防卫基因的表达,提高植物抗病性。SA可以通过充当CAT/APX的单电子供体底物,抑制CAT/APX等H2O2降解酶的活性,最终积累H2O2,达到提高植物抗病性的作用[25]。本研究中,接种处理后0~12hSA处理的短白梗中CAT活性下降,而未经SA处理的CAT活性升高,从而使SA处理的短白梗中H2O2快速积累,起到抵抗黑斑病侵染的作用。24h后两者CAT活性均升高,可能是植物中H2O2诱导表达的结果,从而减轻活性氧的伤害,提高不结球白菜的黑斑病抗性。

SA作为一种新型植物激素在诱导植物抗性方面具有重要作用,本研究结果表明SA处理可以提高

H2O2是一种能自由扩散的小分子,可以跨膜进入病原物侵染以外的组织中,直接抵抗病原物侵染,

不结球白菜的黑斑病抗性。SA及其功能类似物所具有的高效、低成本、无毒、无残留等特点使之在农业生产中显示出广阔的应用前景。

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责任编辑:范雪梅