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甘草黄酮的提取与检测方法研究进展

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第5期(总第352期) 2014年5月 农产品加工(学刊) Academic Periodical of Farm Products Processing No.5 May. 文章编号:1671—9646(2014)05a一0038—05 甘草黄酮的提取与检测方法研究进展 裴炜,李梦洁,柯燕娜,方乙晨,周泽琳 (上海市质量监督检验技术研究院,上海200233) 摘要:甘草黄酮是甘草中含有的一类生物活性较强的成分,具有很高的开发应用价值。对甘草黄酮提取方法和检测 方法的研究现状进行综述,旨在为甘草黄酮的进一步开发利用提供参考。 关键词:甘草黄酮;提取方法;检测方法 中图分类号:TQ464 文献标志码:A doi:10.3969/jissn.1671—9646(X).2014.05.014 Progress on Extracting Techniques and Detecting Methods of C/rc /za Flavonoids PEI Wei,LI Meng-jie,KE Yah-ha,FANG Yi-chen,ZHOU Ze-lin (Shanghai Institute of Quality of Inspection and Technical Research,Shanghai 200233,China) Abstract:G y丌 口flavonoids(FG)is a group of biologically active substances ofund in licorice,with a great value for the development and application.In this paper,the progress in the research of extracting technique and detecting method of FG re reviaewed,riO as to provide some reference for further researchs on the exploitation and utilization of FG. Key words:Gfycyrrhiza lfavonoids;ex ̄acifng technique;detecting method 甘草又名甜草、蜜草、美草等,是临床中最常 用的中药之一,有“十方九草”之称。甘草黄酮是 甘草中非常重要的一类有效成分,有抗病原微生物、 抗氧化、抗炎、抗肿瘤、保肝、抗血栓、抗心肌缺 血、抗心率失常、镇痛、解痉、美白等作用【l1。本文 就近年来甘草黄酮的提取和检测方法的研究进展作 综述,以期为更好地开发利用甘草黄酮提供理论 依据。 一(2)碱水提取法。其原理主要是甘草黄酮易溶 于碱性水,因此可先用碱性水提取,再将碱性水提 取液进行酸化,沉淀析出甘草黄酮成分。王冰等人[31 研究了用Ca(OH) 水溶液提取甘草总黄酮的提取工 艺。但建明等人 在氢氧化钠浓度0.2 mol/L,甘草渣 与提取剂的比例1:14,提取温度9O℃,提取时间 0.5 h的最佳工艺条件下,可使甘草黄酮的提取率高 达96%t”。 (3)半仿生提取法。是从生物药剂学的角度, 模拟口服给药及药物经胃肠道转运过程创立的一种 1.1溶剂提取法 新提取工艺圈。孙秀梅等人嘲模拟人体胃肠道pH值的 根据溶剂的不同,常规提取甘草黄酮的方法主 变化,分3次采用pH值2.0,6.5,9.0的水进行提 要有水提法和有机溶剂提取法2种。 取,研究表明与普通水提法相比半仿生提取法总黄 1甘草黄酮的提取 1.1.1水提法 水提法又可分为普通水提法、碱水提取法、半 仿生提取法等。 (1)普通水提法。其原理主要是利用甘草黄酮 的水溶性,将甘草粉与水按一定比例配比,加热混 合至80~95℃进行提取121。此方法的优点是设备比较 简单,但因提取时间长、提取杂质多、后续过滤操 作困难、提取液存放易变质、提取率较低等缺 点,现已不常使用f21。 酮含量明显增加[1】。徐萍等人 用半仿生提取法优选 桂枝甘草汤方药半仿生提取醇沉(SBAE)法最佳醇 沉浓度。 1.1.2有机溶剂提法 黄酮类化合物易溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮等 有机溶剂中,但不同有机溶剂的提取效果具有一定的 差异性,其中甲醇和乙醇是采用最广泛的溶剂【8J。 于琴等人[91主要采用乙醇回流浸提法提取阿 克苏产甘草废渣中的黄酮类化合物,其最佳提取工 收稿日期:2014-01—02 基金项目:国家质量监督检验检疫总局公益性行业科研专项经费“双打”专项项目任务(2012104013—2)。 作者简介:裴炜(1987一),女,硕士,助理工程师,研究方向为食品、化妆品及保洁用品检验。 2014年第5期 裴炜,等:甘草黄酮的提取与检测方法研究进展 ・39・ 其原理是微波穿透到介质内部,直接作用于分 艺条件为乙醇体积分数75%,料液比1:40,提取时 间4 h,提取温度95℃,并且通过试验研究发现采 子,使其热运动加剧,温度升高,快速破坏细胞壁, 用此法具有较高的准确度和可靠性。刘晓风【 0]和马红 使植物中的有效成分更快地分离提取出来【-l。孙萍等 艳等人【n也利用乙醇回流法确定了甘草黄酮等最佳提 人 U用微波提取技术提取甘草总黄酮,结果表明运 取工艺条件;杨慧等人【 21通过试验采用NaOH和乙醇 用微波技术能使得反应速度加快,而且试验结果令 的混合溶液回流提取内蒙古产甘草渣中黄酮成分; 田庆来等人【・31以三烷基氧化膦一石油醚溶液为萃取有 机相,从甘草浸提液中对水溶性甘草黄酮进行了萃 取分离,并研究了各种影响萃取的因素。 溶剂提取法的优点是设备要求低,操作简便。 但水提法提取时间长,提取率低。使用有机溶剂时 人满意。韩学哲罔也采用微波辅助方法提取甘草渣中 的总黄酮,研究确定了最佳提取工艺条件为80%乙 醇,固液比1:10,微波功率300 W,微波辅助回流 1 h,甘草黄酮含量为1.892%,比文献[21】的结果高 0.1%。张明华圈、史高峰 、朱飞娥等人 也采用微 波辅助乙醇浸取工艺提取甘草黄酮,确定了最佳提 尽管萃取率很高,但产物后处理困难,易造成环境 取工艺条件,效果均很好。 污染,且产品中杂质多,品质不好。加热回流法提 微波辅助提取法具有加热均匀、时间短、品质 取过程中,由于操作温度很高,有效成分容易发生 好、较易实现自动化控制等一系列优点,但在微波 分解或聚合,杂质比较多,后续的分离纯化过程也 萃取过程中需要控制萃取时间和加热温度,避免溶 比较困难。冷浸法提取虽然避免了高温带来的影响, 剂沸腾,这给操作带来了一定的麻烦,萃取效率仍 杂质少,但要达到较高的萃取效率十分费时。碱水 较低,处理量小,仅适用于少量快速的提取fl9】。 提取法虽操作简单,但酸碱浓度要适宜,不能过高 1.4酶提取法 或过低[11。半仿生提取法比普通水提法获得的黄酮含 其原理是利用酶反应所具有的高度专一性等特 量要明显增多,适合工业化生产,能保留更多有效 点,根据植物细胞壁的构成,选择相应的酶,将细 成分,生产周期短,成本低,但高温煎煮会影响活 胞壁水解或降解,使有效成分溶解或混悬于溶剂中, 性成分,降低药效【5】。 从而达到提取的目的【5J。高保英等人圜以纤维素酶和 1.2超声辅助提取法 果胶酶组成的复合酶,在40℃,pH值5.0的条件下 其原理是利用超声波使植物组织在溶剂中瞬时 酶解3 h,其提取率可达16.5%,与微波法的提取率 产生空化泡崩溃,使得细胞破裂,增加了有效成分 相当,而且与微波法提取相比,酶法提取的成本低、 在溶剂中的溶解【5J。刘红等人㈣研究了在超声条件下 耗能低。张志东等人闭利用复合酶法结合醇提法提取 不同提取时间对甘草黄酮提取率的影响,结果表明 甘草废渣中的黄酮,最终提取率达到2.25%,用该法 在室温下超声提取80 min提取率较高。王彦芳等 获得的黄酮含量比直接醇提法提高了25%以上。王 人f 5J研究超声辅助处理对甘草中总黄酮提取效果的影 芸芸等人 也采用纤维素酶和果胶酶组成的复合酶从 响,结果表明在最佳醇提条件(体积分数75%的乙 甘草渣中提取甘草总黄酮,试验结果表明此法提取 醇,料液比1:14,提取时间2 h)下对原料进行超 到的游离总黄酮含量比醇提法提高了1.15倍。 声前处理,确定最佳超声条件为超声功率100 W, 酶法提取具有产品安全性高、生产条件温和、 超声时间1 h,甘草黄酮提取率可达2.69%。马子娇 耗能低、无污染等优点,但酶使用过后不能回收, 等人f1噼j.比采用有机溶剂热回流法、超声辅助有机溶 且反应要求pH值控制精细,由于细胞壁成分比较复 剂热回流法、碱性溶剂提取法、超声辅助碱性溶剂 杂,往往选用单一的酶不能达到较好的提取效果。 提取法这4种方法来提取甘草废渣中的甘草黄酮, 因此,选用合适的酶则非常关键,而且酶制剂价格 结果表明超声辅助有机溶剂热回流法的提取效果最 相对比较昂贵,要想实现工业化生产,还有待进一 好。邹玉红等人㈣以乙醇为提取剂,采用超声辅助法 步研究 。 提取甘草中的总黄酮,并优化了提取工艺,为甘草 1.5超临界流体萃取法 的进一步开发利用提供了科学依据。 超临界流体萃取(SCFE)技术是近20年发展起 超声提取技术的优点是可以大幅度地缩短提取 来的新型分离技术,其原理通过使植物细胞壁高度 时间,提高有效成分的提取率,无需加热,速度快、 破碎,增加细胞组织内部的有效成分与溶剂的接触 效果好,且结构未被破坏【l8J。但超声提取法仍然存在 面积和萃取通道,同时还使黄酮与纤维素结合力降 一些问题,溶剂和水的用量仍然很多,对有效成分 低,从而提高萃取率,该技术现已广泛应用于许多 萃取的选择性差,超声时间与杂质的质量分数成正 天然产物的萃取分离中。赵德胜等人 通过单因素试 比,超声时间短,萃取不充分,时间长则杂质多, 验和正交试验,研究了应用超临界CO 萃取技术萃 产品的品质下降 91。 取甘草黄酮的最佳工艺条件为萃取温度50℃,萃取 1-3微波辅助提取法 压力32 MPa,萃取时间1.5 h,CO2流量20 kg/h,夹 农产品加工(学刊) 2014年第5期 带剂90%乙醇。付玉杰等人帆也通过试验确定超临界 CO 萃取乌拉尔甘草中黄酮的最佳工艺条件为萃取压 力30 MPa,萃取温度50 cI=,原料(甘草根茎粉) 与夹带剂(85%乙醇)比例1:5(g/mL),CO:流量 10 kg/h,分离压力5.5 MPa,分离温度40℃,此法的 甘草黄酮提取率比乙醇溶剂提取法高2.2倍。同样, 付玉杰等人l3 也系统地研究了超临界CO 萃取法提取 甘草地上部分(茎叶)总黄酮的最佳提取工艺,具 有提取率高、纯度高的特点,为规模化生产甘草总 黄酮的提取提供了研究基础。 超临界CO 萃取技术能够使萃取和分离合二为 (钠)还原比色的稳定性较差阁。 吕欣等人【 用紫外分光光度法,以芦丁作对照 品测定了甘草中总黄酮的含量,检测波长为500 nln, 标准曲线相关系数R 为0.999 4,相对标准偏差为 0.20%,平均加样回收率为100.20%。结果表明,此 法准确度较高,为甘草生药及成品药中甘草黄酮含 量测定提供了一种切实可行的方法 。张睿等人 利 用大孔吸附树脂提取甘草中黄酮类化合物,用柚皮 苷作对照品,在413.50 nm处测定了甘草黄酮的含 量,在最佳试验条件下甘草提取物中甘草黄酮的最 大回收率为7.28%,甘草黄酮的含量为53.5%。通过 一,选择性好,萃取率高,适于热敏性物质和易氧 化物质的提取,且萃取流体可循环使用,对人体无 毒害,对环境无污染。缺点是样品量受限(<1O , 要萃取极性物质需加入极性溶剂以及需在高压下操 作,操作过程繁琐,反应条件难控制,设备投资较 高等『181。 1.6闪式提取法 其主要原理是利用高速机械剪切力和搅拌力, 迅速破坏植物细胞组织,使细胞组织内部的有效成 分与溶剂充分接触,快速溶解转移,从而达到提取 的目的[51。邓引梅等人【32]对比研究了闪式提取、索氏 抽提、搅拌提取、超声波提取对胀果甘草叶总黄酮 的提取效果,结果表明用闪式提取法的提取时间短, 提取溶剂用量少,在最佳提取工艺下黄酮的提取率 为2.917%。此后,邓引梅等人【33]又在单因素试验基 础上研究了响应面法确定闪式提取法提取甘草叶中总 黄酮的最优工艺参数,总黄酮的提取率达到2.91%, 与模型预测值基本相符。 闪式提取法的优点是成本低,提取时间短,溶 剂用量少,提取率高,操作性强,灵敏度高;缺点 是对样品的大小要求严格,且溶剂不能与设备发生 反应,操作危险[51。 2甘草黄酮的检测方法 甘草黄酮的检测方法主要为紫外可见分光光度 法、高效液相色谱法、高效液相色谱一质谱联用技 术、薄层扫描法、毛细管电泳法等。 2.1紫外可见分光光度法(uV) uV法是黄酮的定量分析最常用的方法,其原理 是黄酮类的化合物遇碱显色 。甘草中总黄酮的紫外 含量测定方法主要有用芦丁作对照品,亚钠一 铝一氢氧化钠显色;用柚皮苷作对照品,氢氧 化钾显色;用甘草苷为对照品,氢氧化钾显色;用 斛皮素作对照品,三氯化铝乙醇溶液显色以及硼氢 化钾(钠)还原比色等[315。由于芦丁和柚皮苷不是甘 草的黄酮成分,测定结果与用甘草苷为对照品测定 结果差异较大,三氯化铝乙醇溶液显色、硼氢化钾 聚酰胺柱色谱分离后,黄酮的含量可以达到90.26%。 周斌等人【38】以甘草苷为对照品,用紫外分光光度法测 定不同产地甘草中总黄酮的含量。甘草总黄酮的线 性检测范围为0.524~13.100 I ̄g/mL,平均回收率为 100.65%,RSD为2.24%(n=6)。 王淑杰等人[3 睬用甘草苷和甘草查尔酮为双对照 品,利用甘草黄酮类化合物在220~280 nm,340— 390 nm两段波长均出现吸收峰,采用双波长法双对 照品测定甘草总黄酮的含量,平均回收率为96.3% 98.6%,RSD小于1%。该方法操作简便、快速、准 确,具有良好的分析应用前景。 刘建宇等人 用三波长紫外光谱测定法,有效 地消除了光谱吸收峰不对称给定量分析造成的影响, 并校正了基于干扰组分的吸收光谱具有线性吸收产 生的基线倾斜。该方法的平均回收率为98.76%一 101.97%,变异系数小于1%,而且该法操作简便、 快速、准确,具有良好的分析应用前景。 2.2高效液相色谱法(I-It'LC) HPLC法已成为当代分析化学中最主要的检测方 法之一,美国、英国、日本药典中HPLC方法占了 大部分,我国药典中HPLC方法也在逐渐增加,我 国药典中收录了用HPLC法测定甘草黄酮中甘草苷 的含量 。 吴涛等人 将样品加甲醇超声提取后,采用 HPLC检测甘草渣中黄酮含量。采用Waters XTerra RP18型色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 Ixm),乙腈一 0.1%磷酸水溶液(53:47)作为流动相,检测波长 254 nm,柱温25℃。结果显示精密度、重复性、稳 定性良好,该方法可以作为甘草渣中黄酮及相关产 品的检测方法。尚晓娜等人 将样品加70%乙醇超声 提取经0.45 m滤膜过滤后,以Agilent XDB—C18型 色谱柱,乙腈一0.1%的磷酸水溶液进行流动相梯度洗 脱,梯度波长采集法,柱温为室温,流量0.6 mL/min。 结果显示色谱峰分离情况良好,甘草苷、甘草素、 甘草酸铵、异甘草素、甘草查尔酮A和甘草次酸在 各自浓度范围内均具有良好的线性关系。该试验建 立的HPLC同时测定黄酮类、三萜类成分的含量方 2014年第5期 裴炜,等:甘草黄酮的提取与检测方法研究进展 ・41・ 法准确、简便,可作为甘草品质控制的方法之一。 CE法是利用不同离子所带电荷及性质的不同, 张娟等人【4]】也是将样品加醇超声提取,采用 TSKgel—C18 ODS一100Z型色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 Ixm),以乙腈和0.1%甲酸溶液为流动相进行梯度 洗脱,检测波长为280 nm,柱温为室温,洗脱流速为 1.0 mL/min,研究甘草废渣中的黄酮类成分。 HPLC法具有样品用量少、柱子可反复利用、易 回收、速度快、准确性好、灵敏度高、自动化程度 高等优点,但流动相消耗很大且多数有毒性,分析 时间较长,分析成本较高,仪器价格及日常维护费 迁移速率不同以达到分离目的,其高效、高速、微 量和低消耗等优点在分析领域中占有重要的应用和 发展前景。 陈新等人 建立了一个毛细管胶束电动色谱 (MEKC)在线富集——阴离子耗尽进样(ASEI)联 用扫集(Sweeping)技术测定3种甘草黄酮化合物 (异甘草索、甘草素和甘草苷)的方法。在优化试验 条件下,异甘草素、甘草素和甘草苷的富集倍数分 别提高110,120,300倍,检出限分别为0.015, 用也较贵。 2.3高效液相色谱一质谱联用技术(LC—MS) LC—MS技术是近年发展起来的新技术,是液相 色谱高效分离能力和质谱的高灵敏度及能够提供被 分析物骨架结构信息的有机结合,可大大缩短分析 时间,减少原料的浪费,并且能提供更高的选择性 和更低的检测限,对混合物的分析有很高的灵敏度、 选择性以及广泛的适用性 。 薄涛等人 运用LC—MS技术研究分析了不同产 地的甘草药材及其提取物中黄酮类成分,色谱条件: 以柱温为室温,流动相组成为甲醇一水一冰醋酸 (体积比50:50:0.20),流速0.5 mL/min;质谱条 件:API—ES离子化源,正离子模式,质量扫描范围 100~1 000,干燥气流速10 L/min,干燥气温度320 oC, Nebulizer压力30 psig,毛细管电压,正极3.5 kV, 负极3.0 kV,研究表明不同产地的甘草生药中黄酮 类成分的种类和含量有着明显的差别,其高效液相 色谱的指纹图谱存在显著差异。 2.4薄层扫描法 LCs) TLCS法是用一定波长的光照射在经薄层层析后 的层析板上,对具有吸收或能产生荧光的层析斑点 进行扫描,用反射法或透射法测定吸收的强度,以 检测层析谱。 王晓强【 嘴黄酮类成分经氯仿一甲醇一甲酸(体 积比5:1:0.1)的系统展开,采用双波长反射法线 性扫描测定甘草中甘草苷含量。甘草中唯一存在的 异黄酮苷、芒柄花苷的含量也可通过TLCS测得 。 高素莲等人 用薄层光密度法对甘草总皂苷中的甘草 酸和甘草总黄酮中的甘草苷和异甘草苷含量进行了 测定与研究。 此法具有样品用量少、设备简单、操作方便、 灵敏度高、分析速度快、结果准确等特点,但重现 性和分辨率不如高效液相色谱法,常被作为半定量 和定性的方法『蚓。另外,样品无需复杂处理,可同时 平行分离多个样品,分离物的性质不受,还可 提供原始彩色图像,其直观性和可比性均是此法的 独特之处 491。 2.5毛细管电泳法(CE) 0.014,0.011 mg/L,回收率为90.6%一107.0%,相对 标准偏差(RSD)均小于4.5%(凡=3)。 CE法具有进样量少、重现性好、高效、快速、 不易污染等优点,但分离能力比高效液相色谱差。 可研究将其与电化学法、安培检测法等方法联合使 用,这将是未来检测技术中的一个发展趋势。 3结语 综上所述,甘草黄酮不同的提取方法和检测方 法各有优缺点,实际运用时根据提取目的与实际条 件合理选用。甘草黄酮是一类很值得深入研究的有 效成分,目前国内对甘草黄酮类化合物的开发主要 应用于医药、食品、化妆品等工业,多限于粗制品, 价值较低。随着甘草黄酮的不断深入研究,使用先 进的提取分离与检测技术,加快开发研究的步伐很 有必要,未来将有着广阔的应用前景【5】】。 参考文献: 【1] 陈云华,王文全.甘草黄酮类成分提取方法的研究进 展[C】.2006海峡两岸暨CSNR全国第七届天然药物资 源学术研讨会论文集,2006. 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