研究酶比色法与HPLC法测定血清同型半胱氨酸的相关性

研究酶比色法与HPLC法测定血清同型半胱氨酸的相关性

作者：谭全超

来源：《医学信息》2015年第08期

摘要：目的 探究分析甘油三脂试剂盒（酶比色法）和高效液相色谱法（又称高效液相层析，简称HPLC）在测定血清中的同型半胱氨酸（Hcy）的相关性。方法 随机选取10份临床的血清样本，分别运用甘油三脂试剂盒（酶比色法）检测法与高效液相色谱法对每一份血清样本进行Hcy浓度的测定，并分析和评价运用两种不同测定方法，检测所得结果两者之间的相关系数。结果 甘油三脂试剂盒（酶比色法）检测法与高效液相色谱法检测血清样本同型半胧氨酸结果的相关系数为R2=0.9978。结论 甘油三脂试剂盒（酶比色法）检测法与高效液相色谱法在测定血清中的同型半胱氨酸具有明显的一致性。

关键词：酶比色法；甘油三脂试剂盒；高效液相色谱法；同型半胧氨酸；相关性 同型半胱氨酸又称为高半胱氨酸，它是人体内部蛋氨酸在新陈代谢和循环过程中产生的，并且其内部含有一种名为硫氨基酸的物质，是人体进行新生代谢和实现需甲基化反应不可或缺的中间产物，是硫氨基酸的一种形式[1]。目前医学临床测定同型半胧氨酸主要有循环酶法和放射免疫方法、甘油三脂试剂盒检测法和荧光偏振免疫评价分析方法和高效液相色谱法等。因为高效液相色谱法在测定血浆内的同型半胱氨酸浓度时，显现出更高的灵敏度和特异性，是目前医学临床测定血浆内的同型半胱氨酸浓度首要选择的测定方法。此次研究主要通过对比分析甘油三脂试剂盒（酶比色法）检测法和高效液相色谱法在测定血清中的同型半胧氨酸的重要相关性，研究的时间为2012年8月～2013年8月，现将此次研究作如下报告。 1 试剂和仪器

1.1试剂 采用的甘油三脂试剂盒用于检测同型半胧氨酸浓度是产于重庆市中元生物科技有限公司；同型半胧氨酸、三氯乙基磷酸酯阻燃增塑剂和SBDZF均是从Sigma公司采购。甲醇（methyl alcohol）的色谱纯主要是采用美国天地公司生产；EDAT·ZK、磷酸二氢钾、四硼酸钠、三氯乙酸、正磷酸等其他检测试剂都是中国生产的分析纯。

1.2仪器 此次对比研究分析主要采用的仪器有岛津LC-10AVP高效液相色谱仪、保护柱和C18柱芯、分析天平、日立7180全自动生化分析仪、TU-1901紫外分光光度仪。

1.3血清样本 20份血清样本取自于某市某区某医院的检查科，采用甘油三脂试剂盒用于检测同型半胧氨酸浓度是产于重庆市中元生物科技有限公司在日立7180全自动生化分析仪对Hcy浓度进行测定。

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2 方法

2.1酶比色法 采用甘油三脂试剂盒（酶比色法）检测同型半胧氨酸浓度，是产于重庆市中元生物科技有限公司。通过采用二硫苏糖醇（DTT）还原血清样本中氧化型Hcy，其次通过Hcy甲基转移酶的反映和作用，把D-甲硫氨酸中的甲基分化转移到Hcy，从而生成D一蛋氨酸以及L-蛋氨酸。之后D-蛋基酸通过D-蛋氨酸中氧化的作用之下生成双氧水。双氧水和显色试剂10-3.7-双吩噻嗪钠互相作用，并生成亚甲蓝，并分贝测定他们吸收广度的不同变化。具体操作方法为：两份血清样本（样本ΔEA和样本ΔEB）和两组各位两份的校准样品（ΔES1A/ΔES1B/ΔES2A/ES2B），并将试剂RIA样本（ΔEA、ΔEB）和校准样品量（ΔES1A/ΔES1B/ΔES2A/ES2B）定为180、0、180、0、180、0；试剂RIB的样本ΔEA、ΔEB）和校准样品量（ΔES1A/ΔES1B/ΔES2A/ES2B）定为0、180、0、180、0、180。将样品和校准品混合均匀之后，于37度环境下保温5min，完成后测定其吸光度。计算方法为：Hcy浓度（μmol/L）=[校准品2标示值×（ΔEA-ΔES1A）/（ΔES2A-ΔES1B）]-[校准品2标示值×（ΔEB-ΔES1B）/（ES2B-ES1B）]。Hcy检测试剂盒主要采用产于重庆市中元生物科技有限公司的甘油三脂试剂盒（酶比色法）检测血清样本，并按照上述的操作方法在某市某区某医院的检验科通过日立7180全自动生化分析仪结束检测。

2.2HPLC法 色谱条件为：激发波长是380nm，发射波长是510nm。流动相：A相采用的是pH值为3.0且浓度为25mmol/L的磷酸盐缓冲液；B相采用的是甲醇（methyl alcohol）。并按照如下梯度的洗脱流程进行，B相的体积比那户范围是0～9min，5%～10%；9～10min，柱温保持为30度，流速为：1ml/min。

样品的预处理和测定：将三（2-氯乙基）磷酸酯作为还原剂，SBD-F作为衍生剂，C18柱进行分离，NAC为内标，根据内标标准的曲线法对血清样本进行评价和分析。

2.3统计学方法 应用SPSS.13软件进行分析，将酶比色法和高效液相色谱法所测得的数值进行平均值和标准差，并根据计算方法算得t值0.05则表明两种测定结果的比较无显著差异。 相关性的计算：将酶比色法和高效液相色谱法所测得数值给予回归分析，并计算系数r，所得结果应为r≥0.95，两组测定数值呈明显的正线性相关。 3 结果

采用酶比色法检测10份血清样本的结果显示为：1～10份血清样本的测定浓度是[30.2、6.2、9.0、11.0、23.1、66.3、45.1、40.3、30.2、11.6（μmol/L）]；采用高效液相色谱法检测血清样本的结果显示为：1-20份血清样本的测定浓度是[33.8、7.0、10.5、12.5、29.6、72.4、48.2、48.8、34.5、13.9（μmol/L）]；甘油三脂试剂盒（酶比色法）检测法与高效液相色谱法检测血清样本同型半胧氨酸相关性结果的相关系数为R2=0.9978，两种检测方法在检测血清中同型半胧氨酸的相关性具有显著的一致性。

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4 讨论

同型半胱氨酸是在1932年被发现的，其分子结构式为HSCH2（NH2）CO2H，根据流行病学和大量的临床实验结果显示，高含量的同型半胱氨酸和脑血管疾病、冠状动脉的疾病等存在着密不可分的关系[2]。人体血液中的同型半胱氨酸主要以同型半胧氨酸二硫化物和同型半胧氨酸以及胧氨酸一同型半胧氨酸这三种形式存在。正常的人体内部会含有微量的Hcy存在，其大多是以和白蛋白共存结合的形式存在，还原型的Hcy仅占其总量的2%。Hcy的正常参考值随测定方法和种族人群的不同而有所不同，一般正常空腹血浆总Hcy水平为5～15μmol/L。研究表明：Hcy每升高5umol/L脑卒中风险升高59%，缺血性心脏病风险升高32%。此次研究通过对比分析酶比色法和高效液相色谱法用于检测血清中Hcy相关性结果良好，表明通过全自动的分析仪器，及时采用酶比色法进行测定血清中的Hcy浓度，具有消耗检测试剂和血清标本少，操作方法简单，且取得准确的检测结果，是临床早期发现和诊治Hcy相关疾病的重要方法。

参考文献：

[1]张志强，李君义.同型半胱氨酸与冠心病的相关性研究进展[J].国际检验医学杂志，2013，4（04）：11-12.

[2]李进，张卫，邓静嫔等.叶酸、维生素B6、维生素B12对冠心病的二级预防作用[J].中国老年学杂志，2012，1（01）：56-59. 编辑/王敏