胃癌组织中端粒酶活性与细胞周期蛋白D1 表达关系的研究

・基础研究・

胃癌组织中端粒酶活性与细胞周期蛋白D1表达

关系的研究

陈　兵1,刘为纹2,府伟灵3,房殿春2,杨仕明2,周来新4

AstudyofrelationshipbetweentelomeraseactivityandcyclinD1ex2pressioningastriccancertissue

CHENBing,LIOUWei

Southwest

2weng,FUWei2ling,etal

Hospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China

yclinD1inhuman

Abstract:Objective　Toexplorethepossiblerelationshipbetweentelomeraseactivationandcgastriccancertissue.

Methods　TelomeraseactivitywasmeasuredwithTelomerasePCR

(BoehringerMannhei).CyclinD1mRNAlevelwasdetectedwithRTprimarygastriccanceranditsassociated

theprogressingincreaseofcyclinD1overexpressionlevelwasfoundfromlesionandgastriccancer.However,telomeraseactivitsionandgastriccancer.Moreover,correlationanalNAandtelomeraseactivittivation.

Keywords:Stomachneoplasm;Telomerase;Cyclin

ylevelintissuesam

0.05).Conclusion　Atleastinhuman

2ELISAKit

plesof

2PCRELISA.The84tissuesam

2caseswereanalyzed.Results　Theanalysisofclinicalsampledisplayed

gastricbenigndiseasetoprecancerous

geofprecancerousle2

ywaspresentedonlyatserioussta

ysisrevealedasignificantassociationbetweencyclinD1mR2plesofprecancerouslesionand

gastriccancer(r=0.713,P<

gastriccancer,cyclinD1overexpressionmaybeawayoftelomeraseac2

摘　要:目的　探索胃癌组织中端粒酶活性与细胞周期蛋白D1表达之间可能的关系。方法　利用

TelomerasePCR2ELISAKit测量端粒酶活性;利用RT2PCRELISA检测细胞周期蛋白D1mRNA表达水

平。共检测了84例胃癌及其相关性的组织标本。结果　周期蛋白D1异常高表达在胃良性疾病、胃癌前期病变和胃癌组织中均可检出,而端粒酶活性仅在胃癌前期病变和胃癌组织中检出。胃癌前期病变和胃癌组织端粒酶活性与周期蛋白D1表达程度明显正相关(r=0.713,P<0.05)。结论　至少在胃癌组织中,细胞周期蛋白D1异常高表达可能是端粒酶激活的前提之一。关键词:胃肿瘤;端粒酶;细胞周期蛋白

中图分类号:R735.2　　文献标识码:A　　文章编号:100028578(2003)0620449203

0　引言

癌及癌旁和癌前期病变组织为研究对象,观察对比了细胞周期蛋白D1与端粒酶活性表达之间的关系和变化。现报告如下:1　材料和方法

1.1　细胞株和引物　人胃癌细胞系SGC7901由军

端粒酶可能是目前已知特异性最好的广泛肿瘤标志物之一,但迄今仍未能广泛用于临床,一个主要的原因是端粒酶在肿瘤组织中激活的途径尚不清楚[1]。细胞周期的紊乱是导致肿瘤细胞无增殖的重要原因[2]。实际上“端粒假说”中已包括了一些细胞周期负性调节因子紊乱和G1期阻滞这样一些概念[1]。因此推测作用在G1期的细胞周期核心蛋白———细胞周期蛋白D1(CyclinD1)

[3]

事医学科学院引入,为cyclinD

1

和端粒酶活性表达

阳性细胞系[4],用作阳性对照。人白血病细胞系K562由第四军医大学口腔医院生物中心实验室吴

,可能与肿瘤端粒酶的激活有关。我们以胃

军正教授惠赠,为cyclinD作阴性对照。CyclinD

1

1

表达阴性细胞系[4],用

引物根据文献[5]设计并由

收稿日期:2003201203;修回日期:2003203211

基金资助:国家自然科学基金资助项目(No.39980010);中国博士后科学基金资助(中博基199826)

作者单位:1.400038重庆,第三军医大学西南医院内分泌科,2.消化内科,3.检验科,4.病理科

上海生工生物工程公司合成。

1.2　组织标本　分别取自我院、第三军医大学大坪

医院和重庆市第六人民医院手术和胃镜活检标本,其中未经治疗的原发性胃癌30例、食管癌6例、结

・054・肿瘤防治研究2003年第30卷第6期

2.2　标本检测结果　检测结果总结为图3和表1。

肠癌6例,胃癌旁和正常胃粘膜组织20例,胃良性

病变组织22例,均经临床和病理诊断,无化疗和放疗经历。标本搜集至DEPC处理后的容器中置于速冻,-80℃贮藏备用。1.3　端粒酶活性检测　按BoehringerMannheim公司TelomerasePCRELISA试剂盒方法进行。

1.4　RT2PCR　利用BoehringerMannheim公司TitanTMOneTubeRT2PCRSystem进行。1.5　CyclinD1RT-PCRELISA　参照Boehringer2PCRSystem和PCRELISA试剂盒说明书及文献[6]进行。用生物素标记的cyclinD15’端引物替代其中原未标记的对应引物,用BoehringerMannheim公司PCRDIGLabeling取代dNTP。终产物利用EIAV.1.820自动酶联检测仪测A450nm值。1.6　统计学分析及绘图　利用STATISTICA/W5.0统计软件在本校数学教研室罗明奎主任指导下进行。2　结果

2.1　细胞周期蛋白D1RT2PCRELISA的建立　SGC7901胃癌细胞cyclinD

1

可见端粒酶活性和细胞周期蛋白D1mRNA表达水

平都有一个随病程发展而逐渐升高的过程,峰值均出现在进展期胃癌伴转移组,但细胞周期蛋白D1mRNA表达水平在胃良性疾病起即开始明显升高(P<0.05),而端粒酶活性在重度异型增生时才见明显增高(P<0.05)。此外,在胃癌各组中,进展期胃癌伴转移组的细胞周期蛋白D1mRNA表达水平显著高于其它两组(P<0.05),而进展期胃癌组的端粒酶活性明显低于其它两组(P<0.05)。也即早期胃癌组的细胞周期蛋白D1mRNA表达水平与进展期胃癌组差别不明显(P>0.05),但均低于进展期胃癌伴转移组;而早期胃癌组的端粒酶活性较高,接近进展期胃癌伴转移组的水平(P>0.05),但在进展期胃癌不伴转移时有一个明显降低的过程。

Mannheim公司TitanTMOneTubeRT

RT2PCR检测可见

1100bp的特异性基因片段出现,其强度随细胞数量

的减少而减弱(图1)。RT2PCRELISA检测的结果与RT2PCR琼脂糖电泳检测结果吻合(图1、图2)。提示所建立的CyclinD1RT2PCRELISA是一种灵敏、特异的检测方法。

图3　胃癌及其有关疾病与端粒酶

活性和CyclinD1表达水平

表1　CyclinD1表达和端粒酶活性与疾病的关系　　

检测对象　　　　

CyclinD1表达

(A450nm󰁦x±s)1.175±0.3620.292±0.2550.534±0.2020.269±0.1000.271±0.1040.180±0.0110.111±0.0460.049±0.0300.592±0.1820.886±0.434

※△※△※△※○※△※※※※

端粒酶活性

(A450nmx󰁦±s)

1.918±0.5340.874±0.5771.313±0.1850.342±0.1580.121±0.0140.102±0.0280.054±0.0220.079±0.1001.086±0.1441.387±0.582※△※△※△※△□※△※

图1　阳性对照细胞CyclinD1RT2PCR电泳检测结果

进展期胃癌伴转移

进展期胃癌早期胃癌重度异型增生中度异型增生轻度异型增生胃良性病癌旁和正常组织食管癌结肠癌

　　※与癌旁和正常组织比较升高明显(P<0.05),△与重度异型增生比较升高明显(P<0.05),胃癌各组间比较:

□

显著低于其它两组

(P<0.05),○仅显著低于进展期胃癌伴转移(P<0.05)

图2　阳性对照细胞CyclinD1

RT2PCRELISA检测结果

3　讨论

肿瘤被认为是细胞失控的、无增殖而永生

肿瘤防治研究2003年第30卷第6期

化的结果。已经知道的是细胞周期功能紊乱可导致细胞出现无加速增殖的表型,而端粒酶激活也可使细胞表现出永生化的特性[123]。决定细胞增殖与否的“细胞周期钟”和细胞增殖次数的端粒机制之间可能存在着某种必然的联系。

细胞周期中的G1期被认为是细胞周期中决定细胞是否增殖、增殖的速率以及终末分化乃至死亡的重要时相。CyclinD1作用在G1期,具有细胞外增殖信号传感器的作用,参与G0/G1期转换的,因此被认为是细胞周期重要的正性因子和癌基因。

1995～1997年间,我们在进行反义cyclinD1基因的实验中,发现转染反义cyclinD1基因的胃癌细胞似乎丧失了永生化的能力。Holt等总结已有的端粒酶与细胞周期关系的资料,提出了永生细胞端粒酶活性和细胞周期关系的模式:永生细胞受各种诱因进入静息状态,退出细胞周期(G0),停止,端粒酶活性下降。静息细胞也可以重新进入细胞周期,再次激活端粒酶[7]。

本研究的结果表明,胃癌前期病变到胃癌过程中端粒酶活性与cyclinD1mRNA表达水平之间存在有正相关的关系(r=0.713,P<0.05,n=50)。此外,我们还发现cyclinD1mRNA表达水平在胃良性阶段中开始明显升高,而端粒酶活性在胃癌前期病变的重度异型增生阶段才开始出现(表1)。这些结果提示,胃癌组织中端粒酶活性的出现可能是cy2clinD1异常高表达的继发事件,或换言之,cyclinD1可能是端粒酶活性的一个上游事件。尽管检测例数有限,但从我们的实验结果中仍能看出,食管癌和结肠癌中也存在有这种关系的可能。这些结

[4]

[3]

・154・

果与Landberg等乳腺癌细胞周期蛋白D1蛋白水平表达检测的结果也相吻合[8],并从mRNA水平进行

了补充。同时,也验证和补充了“端粒假说”中的一些隐含的内容,即端粒酶激活可能是癌基因激活或抑癌基因失活后癌症发生发展过程中的一个继发共同事件[9]。

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(贺　文校对)