北京．２００２羊肉歇４０巳４６８．４５巳４４压４０８． ４３８．４３０． ０２５０．３０鸡腿住５２吸５０９． ３０象５３象５５９．６１９． ５００．，上ｎ六匕１． １１猪肝 １１７０１１５２１１． ５０１１５５１１６０１１．４９１１．５６众ｎ｝工Ｊ‘ｎ兮０．６９猪瘦肉吼７６伙８５９． ４２９．７７象６３９． ８５９． ７２，．Ｌ６一』ｄ０．０２鲜肉饺６．２５已６０６．６３民４４已２０６． ５２６． ４４１７９０． ０３免肉１５． ７０巧们１５． ４０１５． ４９１５５０１５． ３４１５．４８１２４０． ８０五花肉６． ３０民７０６． ９１６．９０ 已９８６．７２６． ７５０． ２５０． ３７２３不同方法的比较对不同种类的肉类样品，分别用半微量定氮法和自动定氮仪测定挥发性盐基氮含量，结果 基本一致，经配对ｔ检验，Ｐ＞０．０５，证明该两种方法测定结果无显著性差异，符合方法的要求。 采用自动定氮仪法测定肉制品中的挥发性盐基氮。操作方法简单、分析速度快、安全可靠、省时省力，测定一份样品只需６ｍｉｎ即可直接读取出结果，适用于大批量样品的测定，该方法有很高的精密度和准确度，对测定肉制品中的挥发性盐基氮具有一定的实用性和可靠性，值得推厂一。酶联免疫双抗体夹心法检侧保健食品中免痊球蛋白ＩｇＧ 项新华北京市疾病预防控制中心赵丹慧李成文 北京市创伤骨科研究所 牛初乳素含大量的免疫球蛋白，可分为三种亚类，工ｇＧ， Ｉｇｍ，工ｇＡ，其中工ｇＧ占牛初乳素的７５％以上。坛Ｇ作为保健食品的功效因子，具有调节生理功能，增强机体免疫的作用。牛初孚。素中免疫球蛋白的浓度影响吸收率，进而影响产品质量。市场上牛初乳素质量良龚不齐，检；１， ；手段主要依赖高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）， ＨＰＬＣ方法具有较好的分离能力。但要求分析设备条户高，且方法没有特异性，不适合现场分析。本法采用酶联免疫双抗体夹心法，具有快速、灵歇、特异性强的特点，适合以牛免疫球蛋白为功效因子的保健食品分析。ｔ材料与方法ｌ］试剂牛血清白蛋白，琼脂糖，Ｔｗｅｅｎ－２０，购自Ｓｉｇｍａ公司；弗氏完全佐剂〔ＦＣＡ），弗氏不完全 廷＿斤：（ＦＩＣＡ），辣根过氧化物酶，小牛血清，购自中事医学科学院 酶联免疫反应用溶液：磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ， Ｏ．Ｏｌｍｏｌ／Ｌ ＰＨ７．４－０．１５ｍｏｌ／ＬＮａＣＩ），取ＫＨ，ＰＯ，０．２７ｇ， Ｎａ，ＨＰＯ，．１２Ｈｚ０２．８６ｇ， ＫＣ１ ０．２ｇ， ＮａＣｌ ８．８９，用蒸馏水定容１０００ｍＬ， ４＇Ｃ放置。寸声与床逆浓趁价ｏｎ｝｝及祥字乏进表包被液（碳酸盐缓冲液０． ０５ｍｏｌ／Ｌ， ｐＨ９．６），取Ｎａ，Ｃ０３１．．５９ｇ， ＮａＨＣ０３２．９２ｇ，用蒸馏水定容１０ＯＯｍＬ， ４℃放置。 洗涤液与反应稀释液（ＰＢＳＴ），取１０００ｍＬ Ｏ．Ｏｌｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ ｐＨ７．４，加入０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０ｏ封闭液，含０． １％明胶Ｏ．Ｏｌｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ ｐＨ ７．４０底物液，Ａ液。．１Ｍ Ｎａ２ＨＰ Ｂ液。１Ｍ柠檬酸邻苯二胺（ＯＰＤ）溶液（取柠檬酸２１． Ｏｇ，加重蒸水ＩＬ，加入１． ２ｇ ＯＰＤ）， Ｔ作液按Ａ液：Ｂ液＝２： １配制，用时每ｌ００ｍｌ Ｔ作液中加Ｉｍｌ ３％Ｈ，Ｏｚｏ终止液，３．ＯｍｏｌｌＬ ＨＣＩ１． ２仪器 酶联免疫测定仪ＰＢ８００ ＢｉｏＨｉｔ公司紫外可见分光光度计 日本岛津公司酶标板，９６孔，浙江黄盐 Ｉ３实验方法１．３．１免疫原取小牛血清，按李成文［ ‘」方法纯化制备牛工ｇＧ，聚丙烯酞馁凝胶电泳检验纯度。１３．２免疫程序：成年新西兰白兔２只，免疫前预饲Ｉ周，采血制备阴性血清，按李成文方法免疫。双扩散 法测定抗体效价，当１： ６４时，心脏采血，将血室温静止３０ｍｉｎ， ４ Ｃ冰箱过夜，离心分离血清。分装，－２０℃保存。１．３．３兔抗牛ＩｇＧ血清的纯化，纯化方法同上。纯化后的二抗ＩｇＧ浓度按朱利泉方法计算。１． ３．４辣根过氧化物酶标记兔抗牛ＩｇＧ。方法同李成文。标记后二抗ＩｇＧ的效价为１： １００００分装，－２０℃存放。１３５乳粉中ＩｇＧ的提取 取乳粉约２． ＯＯｇ，用３０ｍＬＰＢＳ溶解，逐滴加入３０ｍＬ饱和硫酸按（用浓氨水调节ｐＨ７． ０ ），搅拌，在４℃放置过夜，１０＇Ｃ ３５００ｒｐｍ离心ｌｏｍｉｎ，收集沉淀，重新用３０ｍＬ ＰＢＳ溶解，按上述方法净化，最后用ＰＢＳ定容ＩＯＯｍＬ，取ＩＯｍＬ用ＰＢＳ稀释到ＩＯＯｍＬ。此即为样品提取液，直接用Ｉ卜夕」分析。１．３．６乳粉中牛ＩｇＧ的双扩散法定性取０． １７ｇ琼脂糖溶于１５ｍＬ ＰＢＳ，加热煮沸，冷却至６０＇Ｃ，置于平板，待凝固后，打孔，孔径５ｍｍ，中心孔距周围孔约４ｍｍ，共６个周围孔。将５ １１ Ｌ样品提取液或牛ＩｇＧ置于中心孔，周围孔依次加入５１， １ １０倍比稀释的兔抗牛ＩｇＧ抗体。１．３．７酶联免疫双抗体夹心法的建立１ ０００ｎｇ／孔兔疫牛ＩｇＧ包被３７＇Ｃ２ｈ，或者４＇Ｃ冰箱过液（包被）于 １ ５０ ｕ １／孔ＰＢＳＴ洗涤酶标板４次．每次２－－３ｍｉｎ，甩干酶标板（洗涤）吝 ２００ ｕ １／孔０． １％明胶封闭３７０Ｃ３０ｍｉｎ（封闭）各 洗涤 古 １００１ １ １／孔３倍比稀释牛ＩｇＧ，温育１ｈ（反应）１ ｉｔ京．２００２ｉ涤ｌｏｏｐ １／孔兔抗牛酶标二抗（ＨＲＰ－ＩｇＧ，１：１０００），反应３０ｍｉｎ（标记）１１５０ ｐ Ｉ／孔ＯＰＯ， ３７Ｃ７－１５ｍｉｎ（显色）ｆｘｃｘ１００Ｘ１０＇ ＇Ｘ１００５０ ｐ １／孔３ｍｏ１／ＬＨＣＩ终止，４９０ｎｍ钡哆０。值（测定）３，８计算ｘ二＿田 ｘ－－ｌｏｏｇ样品中ＩｇＧ的克数。ｆ－ 稀释倍数， Ｃ—样品提取液的ＩｇＧ浓度。ｍｇ／ｍＬ，。一一样品质量，ｇ． ２结果与讨论２． １兔抗牛ＩｇＧ的ＩｇＧ特异性用紫外可见分光光度计测定２６０ｎｍ和２８０ｎｍ下的吸光度分别为１． ５４８和２． ５４６，其浓度二１．４５Ａ２１１－０．７４Ａｚｓ。为２．５ｍｇ／ｍＬ，用兔抗牛白蛋白〔ＢＳＡ）血清，羊工ｇＧ，与兔抗牛工ｇＧ抗体进行双扩散试验．结果均没有出 现白色沉淀线。结果表明：兔抗牛ＩｇＧ抗体具有较高的亲合性和选择性，能够专一性与牛ＩｇＧ结合。２． ２乳粉中ＩｇＧ的定性应用环状沉淀反应可实现现场阳性样品的筛选。取样品２．０ｇ， １００ｍＬ水溶解，即可用于分析。取直径５ｍ，的小试管，加入兔抗牛ＩｇＧ的抗体，缓慢加入样品液，３７℃保温１０ｍｉｎ。若出现环状沉淀，为阳性，样品中含有牛ＩｇＧ。可将样品带回实验室。进一步用双扩散法定性。２． ３乳粉中ＩｇＧ的定量直接酶联免疫吸附法以浓度为自变量，浓度分别为：２． ５０ｍｇ／ｍＬ ， ０． ８３ｍｇ／ｍＬ ，０．２８ｍｇ／ｍＬ，０．０９３ｍｇ／ｍＬ，０．０３１ｍｇ／ｍＬ，以吸光度一空白孔的吸光度为因变量，对应的吸光度分别为：２．２６２， １．１５０， ０．５７８， ０．４５６， ０．３４１，计算回归方程和相关系数。ｙ＝０．３５８＋０．７６７ｘ ｒ＝０．９９５进行乳粉中添加牛ＩｇＧ回收实验，回收率为８８．４－９３．２％（ ｎ＝７）．２． ４实际样品的检测分析了以年初乳素为原料的３种保健品，含量分别为０． ８％， １０． ３％， ２０． １％。表明方法可行．３结论 制备了抗牛ＩｇＧ的抗体，该抗体具有较高的亲合性和特异性，适用于保健食品中是否含有牛免疫球蛋白阳性样品的快速筛选，也满足了保健食品牛免疫球蛋白工ｇＧ定量分析的现实需求。
