微生物检测步骤
-CAL-FENGHAI.Network Information Technology Company.2020YEAR
1.菌落总数操作步骤
1.1 检样稀释及培养
1.1.1以无菌操作,取样25 g放入225mL灭菌生理盐水或灭菌乳钵中，经充分振摇作成1：10均匀稀释液。
1.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀，做成1∶100的稀释液。
1.1.3 另取1mL灭菌吸管，按上条操作顺序，做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL火菌吸管。
1.1.4 根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。
1.1.5 稀释液移入平皿后，应及时将凉至45℃营养琼脂培养基 ，注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液的灭菌平皿内作空白对照
1.1.6 待琼脂凝固后，翻转平板(使平皿底朝上)，置36±1℃温箱内培养48±2h。
1.2 菌落计数方法
做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。 1.3 菌落计数的报告 1.3.1 平板菌落数的选择
选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。 1.3.2 稀释度的选择
1.3.2.1 应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之(见表1中例1)。
1.3.2.2 若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字(见表中例2及3)。
1.3.2.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例4)。
1.3.2.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例5)。
1.3.2.5 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(见表1中例6)。
1.3.2.6 若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 1.3.2.7 若只有一个稀释度菌落在适宜计数范围内，计算平均值X 稀释倍数；作为结果；若两个连续稀释度的菌落都在适宜计数范围内时按公式计算：
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表1稀释度选择及菌落数报告方式
两稀释 例次 稀释液及菌落数 10-1 10-2 10-3 液之比 1 多不可计 1 20 菌落总数 报告方式 [cfu/g] 100 16000或1.6×104 2 多不可计 295 46 1.6 37750 38000或3.8×104 3 多不可计 271 60 2.2 27100 27000或2.7×104 4 5 6 600 27 0 350 11 0 313 5 0 313000 270 ＜1×10 310000或3.1×105 270或2.7×102 ＜10 7
多不可计 305 12 30500 31000或3.1×104 3
2.大肠菌群测定步骤
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 操作步骤 2.1 检样稀释
2.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。
2.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
2.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
2.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。 2.2 乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃ 温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。 2.3 分离培养
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将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃ 温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。 2.4复发酵实验
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置 36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。 2.5 报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
MPN检索表 1mL(g)×3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 阳性管数 MPN 0.1mL(g)×3 0.01mL(g)×3 100mL(g) 0 0 30 0 1 30 0 2 60 0 3 90 1 0 30 1 1 60 1 2 90 1 3 120 2 0 60 2 1 90 2 2 120 2 3 160 3 0 90 3 1 130 3 2 160 3 3 190 0 0 40 0 1 70 0 2 110 0 3 150 1 0 70 1 1 110 1 2 150 1 3 190 5
95%可信限 下限 上限 <5 90 <5 130 <5 10 10 30 200 210 230 360 1 1 1 1 1 1 1 1 续表 1mL(g)×3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 3 3 3 3 0 1 2 3 0 1 2 3 110 150 200 240 160 200 240 290 30 360 阳性管数 95%可信限 MPN 0.1mL(g)×3 0.01mL(g)×3 100mL(g) 下限 0 0 90 30 0 1 140 70 0 2 200 0 3 260 1 0 150 30 1 1 200 70 1 2 270 1 3 340 2 0 210 40 2 1 280 100 2 2 350 2 3 420 3 0 290 3 1 360 3 2 440 3 3 530 0 0 230 40 0 1 390 70 0 2 0 150 0 3 950 1 0 480 70 1 1 750 140 1 2 1200 300 1 3 1600 2 0 930 150 2 1 1500 300 2 2 2100 350 2 3 2900 3 0 2400 360 3 1 4600 710 3 2 11000 1500 3 3 24000 上限 360 370 440 0 470 1500 1200 1300 3800 2100 2300 3800 3800 4400 4700 13000 24000 48000 6
注：1.本表采用3个稀释度[1mL(g)、0.1mL(g)、0.01mL(g)]，每稀释度3管。 2.表内所列检样量如改用[10mL(g)、1mL(g)、0.1mL(g)]，表内数字应相应降低10倍；如改用[0.1mL(g)、0.01mL(g)、0.001mL(g)]时，则表内数字应相应增10倍，其余类推。
3.商业无菌的检验方法
商业无菌的概念：
罐头食品的商业无菌是指罐头食品经过适度的热杀菌后，不含有致病的微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物，这种状态称作商业无菌。罐头食品的商业无菌的检验适用于各种密封容器包装的，包括玻璃瓶，金属罐，软包装，经过适度的热杀菌后达到商业无菌，在常温下能较长时间保存的罐头食品。 步骤：
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3.1按取样步骤取样
3.2保温—将样品按照保温试验要求进行保温，保温过程中,每天检查,如有胖听或泄漏等现象,立即取出开罐检测。
罐头种类 温度，℃ 时间，d 低酸性罐头 36±1 10 酸性罐头 30±1 10
预定输往热带地区的低酸性罐头 55±1 5-7 3.3开罐：
取保温过的全部罐头,冷却到室温后,按无菌操作开罐检验。
3.3.1将样罐用温水和洗涤剂洗刷干净，用自来水冲洗后擦干。放入无菌室，以紫外光灯照射30min。
3.3.2将样罐移至超净工作台上，用75%酒精棉擦拭，并点燃灭菌（胖听罐不能烧），用灭菌器具开启。
3.3.3留样：开罐后，以无菌操作取出内容物10-20ml（g）移入灭菌容器内，保存于冰箱中，检验得出结论后可随之弃去。 3.4 PH测定：
取样品测PH值，看与标准是否有显著的差异。
3.5感官的检验：对产品的外观、色泽、状态和气味进行观察、嗅闻，鉴别食品有无变质的迹象。 3.6涂片染色镜检 3.6.1涂片
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对PH检查结果认为可疑的样品进行涂片染色镜检。用接种环挑取样品涂于载玻片上，待干后用火焰固定。 3.6.2染色镜检
用革兰氏染色法染色，镜检，至少观察5个视野，记录细菌的染色反应，形态特征以及每个视野的菌数。与同批的正常样品进行对比，判断是否有明显的微生物增殖现象。 3.7接种培养
3.7.1保温期间出现的胖听泄漏或开罐检查发现PH、感官质量异常，进一步镜检发现有异常数量细菌的样品，均应及时进行微生物接种培养。对需要接种培养的样品用灭菌移液管移出1ml内容物，分别接种培养，接种量为培养基的十分之一。要求在55℃培养基管，在接种前应在55℃水浴锅中预热至该温度，接种后立即放入55℃温箱培养。
3.7.2低酸性产品接种培养基、管数及培养条件见表1 培养基 管数 培养条件 时间(h) 疱肉培养基 2 30±1℃(厌氧) 96—120 疱肉培养基 2 30±1℃(厌氧) 24—72
溴甲酚紫葡萄糖肉汤(带导管) 2 30±1℃(厌氧) 96—120 溴甲酚紫葡萄糖肉汤(带导管) 2 30±1℃(厌氧) 24—72 3.7.3酸性产品接种培养基、管数及培养条件见表2 培养基 管数 培养条件 时间(h) 酸性肉汤 2 30±1℃55 1 (厌氧) 48 酸性肉汤 2 30±1℃30 1 (厌氧) 96
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麦芽浸膏汤 2 30±1℃30 1 (厌氧) 96 3.8微生物培养检验程序及判定
3.8.1见GB47.26—94罐头食品商业无菌的检验。
3.8 .2 对有微生物生长的酸性肉汤和麦芽浸膏汤管进行观察，并涂片染色镜检，按所发现的微生物类型判定。 3.9样品密封性检验
对确定有微生物繁殖的样罐均进行密封性检验以判定该样品是否泄漏。将已经洗净的空罐经35℃烘干，根据各单位的设备条件减压或加压试漏。 4.结果判定
4.1该批产品抽取样品经保温试验未胖听或泄漏；保温后开罐经感官检查、PH值测定或涂片镜检或接种培养，确证无微生物繁殖现象，则为商业无菌。 4.2该批产品抽取样品经保温试验有一罐及一罐以上发生胖听或泄漏；或保温后开罐，经感官检查、PH值测定或涂片镜检和接种培养，确证有微生物繁殖现象，则为非商业无菌。
（1）PH测定判定：PH计的精确度应在已知缓冲溶液的0.1PH单位之内。与同批中正常罐比，看是否有明显差异。一般PH增加0.5算作显著差异。 （2）染色镜检，判定是否有明显的微生物增值现象。根据实践结果，有百倍增长算明显的增殖。
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