ARMSPCR技术介绍基因的变异类型有多种（点击查看），对应的分⼦检测⽅法亦有多种，当前资本市场驱动着分⼦检测市场，并极⼒追捧NGS技术，因为其通量⾼，灵敏度⾼且性价⽐⾼。⼩编承认NGS是分⼦检测的必然发展趋势，但是短时间内，NGS并不会取代其他分⼦检测⽅法，因为针对不同的需求，都有对应的理想检测⽅法，每个检测平台都有着⾃⼰的优势，⽐如：操作简单：PCR，ARMS-PCR，HRM等时间快速：ARMS-PCR，HRM等成本低：PCR，PCR-RFLP，MassARRAY等准确：Sanger等通量⾼：NGS等灵活性：Pyrosequencing等结果分析简单：ARMS-PCR等⾃动化：核酸提取等......⼩编⼀直认为：没有最好的技术，只有最合适的技术！最好的，不⼀定是最合适的；最合适的，才是真正最好的。今天，我们聊⼀聊⼀直以来都⽐较⽕的ARMS-PCR技术，⾸先，我们先了解下什么是ARMS-PCR？ARMS-PCR：扩增阻滞突变系统PCR（Amplification Refractory Mutation SystemPCR，ARMS-PCR），⼜称为等位基因特异性PCR（Allele-Specific PCR，AS-PCR）。ARMS-PCR技术建⽴在等位基因特异性延伸反应基础上，只有当某个等位基因特异性引物的3’末端碱基与突变位点处碱基互补时，才能进⾏延伸反应。常规PCR扩增DNA所⽤的上、下游引物与靶序列完全匹配，⽽等位基因PCR采⽤等位基因特异的两条上游引物，两者在3’端核苷酸不同，⼀个对野⽣型等位基因特异，另⼀个对突变型等位基因特异，在Taq DNA聚合酶作⽤下，与模板不完全匹配的上游引物将不能退⽕，不能⽣成PCR产物，⽽与模板匹配的引物体系则可扩增出产物，通过凝胶电泳或者qPCR就能很容易地分辨出扩增产物的有⽆，从⽽确定SNP基因型，⽬前市场主流为ARMS+qPCR技术，采⽤TaqMan探针进⾏检测。（⽐如肿瘤靶向⽤药EGFR基因检测，CFDA批准的检测试剂盒，90%以上都是ARMS检测⽅法）简⽽⾔之：引物3’端错配的碱基会导致PCR引物延伸速度变慢，当错配达到⼀定程度时，引物延伸将终⽌，得不到特异长度的PCR扩增产物，从⽽提⽰模板DNA没有与引物3’端配对的碱基，反之则有。ARMS-PCR（AS-PCR）检测原理：横向为针对W和M的两条上游引物，纵向为W和M的DNATemplate，可以看出W引物只能特异性扩增W模板，M引物只能特异性扩增M模板。（在此基础上⼜延伸出四引物ARMS-PCR技术（Tetra-Primer ARMS-PCR）：同时使⽤4条PCR引物，两条3’末端位于SNP位点上的分属不同基因型的⽅向相反的内引物（inner Primer），两条位于SNP外侧并与SNP距离不等的外引物（outer Primer），4条引物理论上如果都匹配的话，两两组合可扩增出3条DNA产物（位于同⼀位点的两内引物⽆法产⽣长⽚段扩增产物，多为引物⼆聚体）。但若其中⼀条针对SNP的内引物不匹配，则只能扩增出另外两条DNA⽚段。由于外引物到达SNP距离不同，扩增产物⼤⼩也就不同，通过电影根据局扩增产物的⼤⼩即可判断基因型，同时由外侧引物扩增的长⽚段产物可作为体系的阳性质控）今天主要介绍ARMS+TaqMan探针+qPCR技术我们都清楚ARMS的简单原理，即理论上Taq DNA聚合酶必须在引物3’末端碱基与模板完全互补情况下才能进⾏有效的聚合反应，但由于Taq DNA严谨性受多因素影响，某些情况下，即使引物的3’末端碱基与模板不互补，延伸仍然可以进⾏（如果3′末端只有⼀个碱基的错配，那么是引物是可以错配结合的并可以进⾏延伸的，只是延伸的效率低于那些3′末端正好配对的引物），⽽且不同的3’末端错位（mismatch）有不同的延伸效率（如果在3′末端引⼊了其他的错配碱基，那么错配的数⽬太多或达到⼀定程度，那么3′末端⽆法进⾏延伸），因⽽仅靠引物3’末端⼀个碱基的错配不能充分⽽可靠地区分两个等位基因，进⽽造成假阳性结果。那么如何提⾼引物延伸的特异性？为了提⾼引物延伸的特异性，可在3’端倒数第2位或第3位碱基处引⼊⼀个错配碱基，该错配碱基与3’末端的错配碱基共同作⽤，使引物在与其3’末端不互补的模板中扩增产物率显著降低，⽽引物在与其3’末端互补的模板中正常扩增，引物的错配碱基类型取决于3’末端碱基错配类型。注意：当3’末端是“强”错配（A/G或G/T）时，可以在引物中引⼊⼀个“弱”错配（C/A或C/T）；当3’末端是“弱”错配时，则需要在引物中引⼊⼀个“强错配”；当3’末端是出“中度”错配（A/A、C/C、G/G、T/T）时，可以在引物中再引⼊⼀个“中度”错配。⼀般在3’末端引⼊突变（倒数第3个碱基），可以显著提⾼特异性。提⾼引物特异性，引⼊错配碱基ARMS的特异性引物设计完成后，还需要⼀对等位基因特异性荧光共振能量转移的TaqMan探针，TaqMan探针分别连有两种不同的荧光染料，5’端为荧光基团，3’端连有通⽤的荧光淬灭基团。⼀个完整的探针，淬灭基团和荧光基团在空间上特别靠近⽽产⽣荧光淬灭。正常情况下检测不到5’端荧光基团发出的荧光，只能检测到3’端淬灭基团的背景荧光。在靶基因扩增过程中，PCR引物和荧光标记探针在退⽕时均会与⽬标序列互补结合（Probe Tm⽐较⾼，需在Primer 之前与DNA Template 结合）。Taq 酶在延伸模板链延伸时遇到与模板稳定结合的探针，Taq酶的5’-3’外切核酸酶会将与模板结合的特异性探针降解，从⽽使探针上的荧光基团因为物理空间分离，淬灭效应消失，发出荧光。如果荧光探针与⽬标序列存在错配，就会⼤⼤减少荧光的释放量。后续通过软件分析处理荧光数据⽽确定基因型。ARMS-TaqMan检测原理TaqMan-MGB探针技术是在TaqMan法基础上优化⽽成的⼀个SNP检测⽅法（由普通Taqman探针和MGB基团两部分组成），该探针的3’端结合了⼩沟结合物（minor groovebinder，MGB），MGB与DNA螺旋的⼩沟（minor groove）契合，通过稳定DNA双螺旋结构来提⾼杂交的准确性和稳定性。这使得探针长度进⼀步缩短，TM值较⾼，增加了探针的杂交稳定性，使结果更准确。该探针结合的为⾮荧光淬灭基因，这可⼤⼤降低荧光本底，提⾼反应灵敏度。MGB探针设计应使SNP位点处于探针中间1/3范围内，尽量缩短MGB探针长度，但不少于13个碱基。TaqMan-MGB检测原理ARMS⽅法与MGB⽅法对⽐：ARMS⽅法灵敏度⾼，需要在qPCR上通过CT值进⾏判断，MGB⽅法灵敏度较⾼，PCR跑完之后⼀般直接⽤qPCR扫版即可，会出现Cluster的现象，⼀般会有三个簇，⼀簇野⽣，⼀簇杂合，⼀簇纯合突变。TaqMan系统有提供它⾃⼰的引物/探针设计软件，即来⾃于ABI的Primer Express 2.0，这⼀款软件是实时荧光PCR实验中应⽤最⼴发的Oligo设计程序，其可⽤于以TaqMan为探针标准的DNA PCR、RE-PCR、巢式PCR、等位基因特异的PCR、多重PCR的寡核苷酸设计。该软件有⼀个引物校验⽂件，可根据其Tm值、⼆级结构和形成引物⼆聚体的可能性，来评价预先设计的引物。该软件除了适⽤于TaqMan探针外，也适⽤于TaqMan-MGB探针，可为单个及多个（⾄48）序列设计探针。ARMS-PCR法应⽤实例介绍⽐如现在有两名⼥性肺腺癌患者，检测EGFR L858R突变后使⽤吉⾮替尼半年，现在想看看是否耐药，需针对EGFR T790M突变进⾏检测。我们采⽤ARMS-PCR⽅法进⾏检测，⾸先设计⼀对针对T790M突变位点的特异性引物，外加⼀条TaqMan探针，然后加上mix混匀上qPCR检测即可。qPCR检测结果参考内参基因进⾏解读，通过baseline划线之后，确定产物ct值与内参基因ct值的⼤⼩，如果ct值⽐内参ct值⼩，即是没有T790M突变，则为野⽣型，对吉⾮替尼还是敏感的（见下图左侧）：如果ct值⽐内参ct值⼤，即是T790M突变，则为突变型，对吉⾮替尼耐药，可使⽤AZD9291（见下图右侧）。市场上有些上市的ARMS-PCR产品会添加Block（block其实就像普通的Taq man-MGB⾥⾯的MGB探针，⼀段Oligo序列，⽬的是封闭野⽣型提⾼检测的灵敏度），Block添不添加主要的决定因素是引物的特异性如何，如果特异性不好可以考虑添加Block提⾼检测灵敏度，其实引物⾜够好的话，block是不需要的。block的序列要有⼀定的特异性，也不⼀定要⾮常好，只要能影响PCR效率，就可以和引物⼀起去筛了，这个是完全从实验结果来说的，理论上的很多对block设计⾏不通，因为它是部分竞争。Block封闭⼀点突变没有关系，只要对突变的扩增效率影响⽐对野⽣的影响⼩，然后整体扩增效率能达到你要求就可以。block还是好筛的，关键还是引物，假阳性假阴性的关键都在前引物。⾼分辨前引物与Block寡聚核苷酸竞争，提⾼检测的灵敏度整个实验主要操作步骤ARMS-PCR技术点评优点：1，操作简单；2，时间快速；3，灵敏度⾼，可检测低⾄1%的突变；4，只有⼀次开盖过程，有效防⽌污染；5，整个操作只需Real-time PCR仪；6，有⼤量成熟的商品化试剂盒提供；7，成本较低（LDT）。缺点：1，通量较低；2，不能检测未知突变；3，不适于位点附近GC含量过⾼或过低的SNP的分型检测。此⽅法适宜于对通量要求不⾼的实验室进⾏突变检测，特别是体细胞突变。
