MSP引物设计原则：1．正、反向引物Tm值差异不能太大；
2．甲基化引物T碱基重复最大不得超过8个，非甲基化引物不得超过5个；
3．引物3`端最少有一个CpG, 至少一个CpG的C碱基出现在末端3个碱基内，且3`端的CpG越多越好；
4．甲基化引物和非甲基化引物应含有相同的CpG位点， 非甲基化引物应比甲基化引物长以弥补C-T转换后导致的Tm值降低；
5．甲基化引物与非甲基化引物的Tm值尽可能一致，一般来说相差不应超过5℃；
一般性PCR引物设计原则
长度：15—30bp，其有效长度[Ln＝2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度)，从而降低产物的特异性。
G十c含量：应在45％一55％之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。
碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。
引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。
引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤
应避免3’端的互补重叠。
特异性：与非特异扩增序列的同源性应小于70％，或少于连续8个的互补碱基。
2．引物的3’端：引物的3’端很人程度上影响Taq酶的延伸效应，除特殊情况(AS－PCR)外，3’端不应发生错配。等发现，引物的3’端发生错配时，A：A使产量下降至l／20，A：G或C：C下降至1／100。当末位碱基是T时，即使错配也能引发链的合成，而为A时错配的引发效率最低，G、C居间。因此，引物的3’端碱基最好选用A、G、C，而尽可能地避免选用T，尤应避免连续出现2个以上的T。
此外，如果扩增编码区域，引物的3’端不要终止于密码了的第3位，因此处易发牛简并，从而影响扩增持异性。
3．避开引物的二级结构区：某些引物无效的原因是引物重复区二级结构的影响，因此选择扩增片段时应注意避开二级结构区，有些计算机软件可帮助确定该区域，如不能避开，则可用7 －deaza－2’－脱氧GTP取代‘dGTP，有助干PCR成功。
