一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 108635372 A(43)申请公布日 2018.10.12

(21)申请号 201810473945.3(22)申请日 2018.05.17

(71)申请人 广东芙金干细胞再生医学有限公司

地址 523808 广东省东莞市松山湖高新技

术产业开发区高科技园桃园路1号莞台生物技术合作中心1栋1楼09室(72)发明人 程蕊苹　雷娟　邓志宏　(51)Int.Cl.

A61K 35/28(2015.01)A61K 8/98(2006.01)A61Q 19/00(2006.01)A61L 27/38(2006.01)

权利要求书1页 说明书7页 附图7页

(54)发明名称

一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法

(57)摘要

本发明涉及一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法，包括如下步骤：（1）利用无血清培养基进行人间充质干细胞的培养，取上清液；（2）对步骤（1）得到的上清液进行超滤法处理后，获得所需要的外泌体；（3）利用乳酸钠林格注射液对步骤（2）得到的外泌体进行重悬处理，得到外泌体悬液；（4）在步骤（3）得到的外泌体悬液中按质量比例加入氯化钠、氯化钾、乳酸钠、氯化钙、葡萄糖、必须氨基酸、非必须氨基酸、人血清白蛋白，即为所制备的外泌体生物制剂，该发明所制备的外泌体生物制剂具有较好的稳定性、生物相容性、生物稳定性。

CN 108635372 ACN 108635372 A

权　利　要　求　书

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1.一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）利用无血清培养基进行人间充质干细胞的培养，取上清液；（2）对步骤（1）得到的上清液进行超滤法处理后，获得所需要的外泌体；（3）利用乳酸钠林格注射液对步骤（2）得到的外泌体进行重悬处理，得到外泌体悬液；（4）在步骤（3）得到的外泌体悬液中按质量比例加入氯化钠（0.1-2%）、氯化钾（0.1-1%）、乳酸钠（0.1-1%）、氯化钙（0.1-1%）、葡萄糖（0.05-5%）、必须氨基酸（0.01-5%）、非必须氨基酸（0.01-5%）、人血清白蛋白（0.1-10%），即为所制备的外泌体生物制剂。

2.如权利要求1所述的一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述上清液进行超滤法处理,具体包括如下步骤:

a、将收集到的上清液分装于50mL的离心管中，在4℃ ,300g离心10min，除去残余细胞；2000g离心20min，除去细胞碎片；收集上清液并用0.22μm孔径的过滤器进行过滤；

b、将步骤（1）收集到的上清液加入装有超滤膜的旋转超滤仪中，接通氮气并将最大进气压力控制在517.125kPa以下，打开磁力搅拌器；待上清液超滤完毕后，加入200-500mL 生理盐水并再次超滤，重复3-5次。

3.如权利要求1所述的一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）得到的外泌体悬液，需进行蛋白浓度的检测后，再添加步骤（4）所述的物质。

4.如权利要求1所述的一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述生物制剂的具备方法是:

1)将人间充质干细胞利用含10%FBS（GIBCO）的alpha-MEM液体培养基进行悬浮为细胞悬液，并调整细胞浓度为1×106/ml-2×106/ml；

2)按照3E7/细胞工厂进行接种，培养至细胞融合度至70%-80%，细胞处于增殖的最佳时机，培养时间为2-3天；

3)将细胞工厂中液体倾倒，并用alpha-MEM液体培养基对细胞工厂进行洗涤，在这个过程中使用alpha-MEM液体培养基进行洗涤一方面将细胞工厂中残余的FBS清除；

4)在细胞工厂中加入1250ml的alpha-MEM液体培养基；5)在37℃，5%的CO2条件下培养96小时，收集得到MSC培养液；6)取5）中收集的上清液，进行离心处理（300-1000g/min，5min),去除细胞碎片，收集上清液弃去沉淀；

7）将6）中收集的上清液进行二次离心（1000g-2000g/min,15min)；去除凋亡小体，收集上清液，弃去沉淀；

8）将7）中收集的上清液利用旋转超滤仪进行超滤处理，以收集培养液中分泌的外泌体；

9） 利用乳酸钠林格注射液洗涤超滤膜上的外泌体，洗涤三次，将洗涤液混合后利用BCA试剂盒进行蛋白定量；

10）根据9）中蛋白定量的结果计算浓度后，按质量比例添加葡萄糖，人血清白蛋白，氨基酸，非必需氨基酸，后置于磁力搅拌器进行搅拌20min，从而使外泌体均匀分散于保存液中后，并置于-20度保存。

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一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法

技术领域

[0001]本发明属于生物医药领域，具体涉及一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法。

背景技术

[0002]外泌体（exosome)最早于1983年被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。它作为人体内一类重要的囊泡，由活细胞分泌的一种双层膜状结构的小囊泡，直径约40-150nm, 携带了母细胞重要的信号分子，例如蛋白质、mRNA、miRNA和脂质等，通过与靶细胞的结合而细胞功能，参与细胞间交流。[0003]目前有多项研究表明，人间充质干细胞源外泌体能够参与皮肤再生过程中的信号传递，具有很强的抗氧化作用，并在多个器官的生理及病理状态下的再生过程的信号分子的协作中起到重要的作用。

[0004]专利号为201710262634 .8的专利申请,是关于人间充质干细胞源性生物活性制剂得制备方法及应用的专利申请,其公开了将外泌体生物活性制剂做成冻干粉形式，并溶解于甘油等组成得溶液中，最后得到外泌体的混悬液；将混悬液进行离心处理收集沉淀干燥后得到美容制剂。

[0005]但这种方法存在明显的不足：1.外泌体在反复的冷冻干燥过程中会损伤外泌体的囊泡结构降低外泌体的作用活性，从而影响后期的治疗效果；2.这种美容制剂中添加太多其他成分，而这些成分本身不具备治疗效果，会影响或减弱外泌体的治疗作用。发明内容

[0006]本发明的目的是为了克服现有技术问题中关于生物制剂的保存效果不理想的技术缺陷。

[0007]为此，本发明提供了一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）利用无血清培养基进行人间充质干细胞的培养，取上清液；（2）对步骤（1）得到的上清液进行超滤法处理后，获得所需要的外泌体；（3）利用乳酸钠林格注射液对步骤（2）得到的外泌体进行重悬处理，得到外泌体悬液；（4）在步骤（3）得到的外泌体悬液中按质量比例加入氯化钠（0.1-2%）、氯化钾（0.1-1%）、乳酸钠（0.1-1%）、氯化钙（0.1-1%）、葡萄糖（0.05-5%）、必须氨基酸（0.01-5%）、非必须氨基酸（0.01-5%）、人血清白蛋白（0.1-10%），即为所制备的外泌体生物制剂。[0008]所述上清液进行超滤法处理,具体包括如下步骤:

a、将收集到的上清液分装于50mL的离心管中，在4℃ ,300g离心10min，除去残余细胞；2000g离心20min，除去细胞碎片；收集上清液并用0.22μm孔径的过滤器进行过滤；

b、将步骤（1）收集到的上清液加入装有超滤膜的旋转超滤仪中，接通氮气并将最大进气压力控制在517.125kPa以下，打开磁力搅拌器；待上清液超滤完毕后，加入200-500mL 生

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理盐水并再次超滤，重复3-5次。[0009]所述步骤（3）得到的外泌体悬液，需进行蛋白浓度的检测后，再添加步骤（4）所述的物质。

[0010]所述生物制剂的具备方法是:

1)将人间充质干细胞利用含10%FBS（GIBCO）的alpha-MEM液体培养基进行悬浮为细胞悬液，并调整细胞浓度为1×106/ml-2×106/ml；

2)按照3E7/细胞工厂进行接种，培养至细胞融合度至70%-80%，细胞处于增殖的最佳时机，培养时间为2-3天；

3)将细胞工厂中液体倾倒，并用alpha-MEM液体培养基对细胞工厂进行洗涤，在这个过程中使用alpha-MEM液体培养基进行洗涤一方面将细胞工厂中残余的FBS清除；

4)在细胞工厂中加入1250ml的alpha-MEM液体培养基；5)在37℃，5%的CO2条件下培养96小时，收集得到MSC培养液；6)取5）中收集的上清液，进行离心处理（300-1000g/min，5min),去除细胞碎片，收集上清液弃去沉淀；

7）将6）中收集的上清液进行二次离心（1000g-2000g/min,15min)；去除凋亡小体，收集上清液，弃去沉淀；

8）将7）中收集的上清液利用旋转超滤仪进行超滤处理，以收集培养液中分泌的外泌体；

9） 利用乳酸钠林格注射液洗涤超滤膜上的外泌体，洗涤三次，将洗涤液混合后利用BCA试剂盒进行蛋白定量；

10）根据9）中蛋白定量的结果计算浓度后，按质量比例添加葡萄糖，人血清白蛋白，氨基酸，非必需氨基酸，后置于磁力搅拌器进行搅拌20min，从而使外泌体均匀分散于保存液中后，并置于-20度保存。

[0011]本发明的有益效果：本发明提供的这种新型的人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法，相比现有技术具有以下优点：（1）本发明所制备的外泌体生物制剂具有较好的稳定性，在-20度保存1年后的外泌体囊泡80%以上仍保持完整结构，在4度保存1个月后的外泌体囊泡70%以上仍保持完整结构；（2）本发明所制备的外泌体生物制剂具有较好的生物相容性，因外泌体生物制剂中包含保持晶体渗透压和胶体渗透压的各种离子和蛋白，具有较好的生物相容性，可添加到美容制剂，组织工程产品，药物制剂中；（3）本发明所制备的外泌体生物制剂具有较好的生物活性，因为外泌体的分离采用超滤法进行，对囊泡各种成分损伤较小，因此，这种因子，蛋白，核酸的活性几乎不受影响。[0012]以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。

附图说明

[0013]图1a是人间充质干细胞形态学示意图。

[0014]图1b是人间充质干细胞的流式鉴定示意图。

[0015]图2a是人间充质干细胞在诱导培养基诱导下进行分化的示意图。[0016]图2b为人间充质干细胞在成骨诱导液诱导下，成软骨分化基因的表达情况统计图。

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图2c为人间充质干细胞在成脂诱导液诱导下，成脂分化相关基因的表达情况统计

图。

图2d为人间充质干细胞在成软骨诱导液诱导下，成软骨分化相关基因的表达情况

统计图。

[0019]图3a是外泌体在促细胞迁移功效学检测示意图。

[0020]图3b是外泌体在促细胞迁移功效学检测定量统计示意图。

[0021]图4a是为对照组在添加了外泌体的培养基在成纤维细胞周期检测结果示意图。[0022]图4b为UV照射组在添加了外泌体的培养基在成纤维细胞周期检测结果示意图。[0023]图4c是为WMT组在添加了外泌体的培养基在成纤维细胞周期检测结果示意图。[0024]图4d为周期检测结果的统计学分析结果示意图。[0025]图5a为不同保存温度下，外泌体在不同的时间点在促进细胞增殖方面的检测结果示意图。

[0026]图5b在不同保存温度下下保存1个月，外泌体在促进细胞增殖方面的检测结果。具体实施方式

[0027]为进一步阐述本发明达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及实施例对本发明的具体实施方式、结构特征及其功效，详细说明如下。[0028]实施例1

为了克服现有技术问题中关于生物制剂的保存效果不理想的技术缺陷；本发明提供一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）利用无血清培养基进行人间充质干细胞的培养，取上清液；（2）对步骤（1）得到的上清液进行超滤法处理后，获得所需要的外泌体；（3）利用乳酸钠林格注射液对步骤（2）得到的外泌体进行重悬处理，得到外泌体悬液；（4）在步骤（3）得到的外泌体悬液中按质量比例加入氯化钠（0.1-2%）、氯化钾（0.1-1%）、乳酸钠（0.1-1%）、氯化钙（0.1-1%）、葡萄糖（0.05-5%）、必须氨基酸（0.01-5%）、非必须氨基酸（0.01-5%）、人血清白蛋白（0.1-10%），即为所制备的外泌体生物制剂。[0029]所述上清液进行超滤法处理,具体包括如下步骤:

a、将收集到的上清液分装于50mL的离心管中，在4℃ ,300g离心10min，除去残余细胞；2000g离心20min，除去细胞碎片；收集上清液并用0.22μm孔径的过滤器进行过滤；

b、将步骤（1）收集到的上清液加入装有超滤膜的旋转超滤仪中，接通氮气并将最大进气压力控制在517.125kPa以下，打开磁力搅拌器；待上清液超滤完毕后，加入200-500mL 生理盐水并再次超滤，重复3-5次。[0030]所述步骤（3）得到的外泌体悬液，需进行蛋白浓度的检测后，再添加步骤（4）所述的物质。

[0031]所述生物制剂的具备方法是:

1)将人间充质干细胞利用含10%FBS（GIBCO）的alpha-MEM液体培养基进行悬浮为细胞悬液，并调整细胞浓度为1×106/ml-2×106/ml；

2)按照3E7/细胞工厂进行接种，培养至细胞融合度至70%-80%，细胞处于增殖的最佳时机，培养时间为2-3天；

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3)将细胞工厂中液体倾倒，并用alpha-MEM液体培养基对细胞工厂进行洗涤，在这个过程中使用alpha-MEM液体培养基进行洗涤一方面将细胞工厂中残余的FBS清除；

4)在细胞工厂中加入1250ml的alpha-MEM液体培养基；5)在37℃，5%的CO2条件下培养96小时，收集得到MSC培养液；6)取5）中收集的上清液，进行离心处理（300-1000g/min，5min),去除细胞碎片，收集上清液弃去沉淀；

7）将6）中收集的上清液进行二次离心（1000g-2000g/min,15min)；去除凋亡小体，收集上清液，弃去沉淀；

8）将7）中收集的上清液利用旋转超滤仪进行超滤处理，以收集培养液中分泌的外泌体；

9） 利用乳酸钠林格注射液洗涤超滤膜上的外泌体，洗涤三次，将洗涤液混合后利用BCA试剂盒进行蛋白定量；

10）根据9）中蛋白定量的结果计算浓度后，按质量比例添加葡萄糖，人血清白蛋白，氨基酸，非必需氨基酸，后置于磁力搅拌器进行搅拌20min，从而使外泌体均匀分散于保存液中后，并置于-20度保存。[0032]综上所述，该人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法，相比现有技术具有以下优点：（1）本发明所制备的外泌体生物制剂具有较好的稳定性，在-20度保存1年后的外泌体囊泡80%以上仍保持完整结构，在4度保存1个月后的外泌体囊泡70%以上仍保持完整结构；（2）本发明所制备的外泌体生物制剂具有较好的生物相容性，因外泌体生物制剂中包含保持晶体渗透压和胶体渗透压的各种离子和蛋白，具有较好的生物相容性，可添加到美容制剂，组织工程产品，药物制剂中；（3）本发明所制备的外泌体生物制剂具有较好的生物活性，因为外泌体的分离采用超滤法进行，对囊泡各种成分损伤较小，因此，这种因子，蛋白，核酸的活性几乎不受影响。[0033]实施例2

1. 细胞准备（1）复苏：选好所需复苏的细胞，在提前预热好的37℃恒温水浴锅中快速溶解，时间控制在1分钟左右，将溶解后的细胞悬液吸出放入提前准备好的培养液中1000r/min离心5分钟，

（2）活率计算及细胞计数，并进行细胞接种。接种后应按划十字法轻微往复晃动培养瓶/皿，使细胞均匀分布，标记好细胞批次、代数、传代日期后，置于细胞培养箱内继续培养，待细胞汇合至85%左右传代，次日换液。[0034]2. 细胞传代

（1）复苏细胞三天后，形态学观察拍照。弃掉培养上清液，采用移液管吸取用生理盐水至细胞培养瓶，平放，轻微振荡，洗去培养瓶内残余的培养基，弃去。[0035]（2）消化：加入适量的0.125%胰酶，振荡均匀后放置于培养箱，37℃消化细胞1～3min。镜下观察细胞全部缩为圆形后加入等量含血清培养基终止消化。[0036]（3）收集：用吸管均匀吹打培养瓶贴壁细胞一面，移入一次性50ml离心管内，1000-1500r/min离心5分钟。[0037]（4）细胞接种：采用培养液将细胞密度调整为2-5E4/ml，接种于10层细胞工厂中，

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按划十字法轻微往复晃动，使细胞均匀分布标记好细胞批次、代数、传代日期后，置于细胞培养箱内，接入气泵，继续培养。[0038]3、收集培养液

（1）传代后第三天，将细胞工厂中细胞进行形态学观察并拍照。[0039]（2）将细胞工厂中的液体收集如液体收集容器中。[0040]4、培养液超滤处理

（1）将3中收集的培养液，将收集到的细胞上清液分装于50mL离心管中，4℃ 300g离心10min除去残余细胞，2000g离心20min除去细胞碎片，小心收集上清液并用0.22μm孔径过滤器进行过滤。[0041]（2）将收集到的上清液加入装有超滤膜的旋转超滤仪中，接通氮气并将最大进气压力控制在517.125kPa以下，打开磁力搅拌器。待上清液超滤完毕后，加入200-500mL 生理盐水并再次超滤，重复3-5次。超滤完毕后，用50ml 乳酸钠林格注射液悬浮超滤膜上的外泌体。

[0042]5. 蛋白浓度测定

将4中所获得外泌体溶液利用BCA检测试剂盒参照说明书进行蛋白浓度的检测， 测定后对所获得的样品进行标记。[0043]6. 根据5）中蛋白定量的结果计算浓度后按质量浓度比例添加氯化钠（0.1%）、氯化钾（0.1%）、乳酸钠（0.1%）、氯化钙（0.1%）、葡萄糖（0.05%）、必须氨基酸（0.01%）、非必须氨基酸（0.01%）、人血清白蛋白（0.1%）后置于磁力搅拌器进行搅拌20min后，置于-20度保存。[0044]实施例3

1. 细胞准备（1）复苏：选好所需复苏的细胞，在提前预热好的37℃恒温水浴锅中快速溶解，时间控制在1分钟左右，将溶解后的细胞悬液吸出放入提前准备好的培养液中1000r/min离心5分钟，

（2）活率计算及细胞计数，并进行细胞接种。接种后应按划十字法轻微往复晃动培养瓶/皿，使细胞均匀分布，标记好细胞批次、代数、传代日期后，置于细胞培养箱内继续培养，待细胞汇合至85%左右传代，次日换液。[0045]2. 细胞传代

（1）复苏细胞三天后，形态学观察拍照。弃掉培养上清液，采用移液管吸取用生理盐水至细胞培养瓶，平放，轻微振荡，洗去培养瓶内残余的培养基，弃去。[0046]（2）消化：加入适量的0.125%胰酶，振荡均匀后放置于培养箱，37℃消化细胞1～3min。镜下观察细胞全部缩为圆形后加入等量含血清培养基终止消化。[0047]（3）收集：用吸管均匀吹打培养瓶贴壁细胞一面，移入一次性50ml离心管内，1000-1500r/min离心5分钟。[0048]（4）细胞接种：采用培养液将细胞密度调整为2-5E4/ml，接种于10层细胞工厂中，按划十字法轻微往复晃动，使细胞均匀分布标记好细胞批次、代数、传代日期后，置于细胞培养箱内，接入气泵，继续培养。[0049]3、收集培养液

（1）传代后第三天，将细胞工厂中细胞进行形态学观察并拍照。

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（2）将细胞工厂中的液体收集如液体收集容器中。

[0051]4、培养液超滤处理

（1）将3中收集的培养液，将收集到的细胞上清液约分装于50mL离心管中，4℃ 300g离心10min除去残余细胞，2000g离心20min除去细胞碎片，小心收集上清液并用0.22μm孔径过滤器进行过滤。[0052]（2）将收集到的上清液加入装有超滤膜的旋转超滤仪中，接通氮气并将最大进气压力控制在517.125kPa以下，打开磁力搅拌器。待上清液超滤完毕后，加入200-500mL 生理盐水并再次超滤，重复3-5次。超滤完毕后，用100ml 乳酸钠林格注射液悬浮超滤膜上的外泌体。

[0053]5. 蛋白浓度测定

将4中所获得外泌体溶液利用BCA检测试剂盒参照说明书进行蛋白浓度的检测， 测定后对所获得的样品进行标记。[0054]根据5）中蛋白定量的结果计算浓度后按比例添加氯化钠（1%）、氯化钾（1%）、乳酸钠（5%）、氯化钙（1%）、葡萄糖（5%）、必须氨基酸（10.01%）、非必须氨基酸（1%）、人血清白蛋白（10%）后置于磁力搅拌器进行搅拌20min后，置-20度保存。[0055]实施例4

结合附图对上述实施例1、实施例2、实施例进行进一步的说明。图1为人间充质干细胞鉴定图片。其中图1a为人间充质干细胞形态学照片，从图中可以看出，人间充质干细胞为长梭形贴壁细胞，图1b为人间充质干细胞的流式鉴定图，流式鉴定结果符合国际细胞治疗协会对间充质干细胞的要求。

[0056]图2a为人间充质干细胞诱导培养基诱导下分化的结果，向脂肪细胞分化的结果显示染色后较多脂肪滴，所获得人间充质干细胞可向脂肪细胞分化；向成骨细胞分化的结果显示染色后有较多的钙结节，所获得人间充质干细胞可向成骨细胞分化；向成软骨细胞分化的结果显示所获得人间充质干细胞可向软骨细胞分化。图2b为人间充质干细胞在成骨诱导液诱导下，成软骨分化基因的表达情况，表明人间充质干细胞可在成骨诱导液下向成骨细胞分化。图2c为人间充质干细胞在成脂诱导液诱导下，成脂分化相关基因的表达情况，结果表明人间充质干细胞可在成脂诱导液诱导下向成脂细胞分化。图2d为人间充质干细胞在成软骨诱导液诱导下，成软骨分化相关基因的表达情况，结果表明人间充质干细胞可在成软骨诱导液诱导下向成软骨细胞分化。[0057]图3 a图为外泌体在促细胞迁移功效学检测图片。从图中相对于对照组外泌体可促进成纤维细胞的迁移。图3b图为图3a图中迁移率的定量统计结果，其结果显示对于对照组的迁移率，外泌体组由较高的迁移率，提示，提示外泌体在皮肤的损伤修复过程中可能起到重要的作用。[0058]图4 a图为对照组在添加了外泌体的培养基在成纤维细胞周期检测结果，图4 b图为UV照射组在添加了外泌体的培养基在成纤维细胞周期检测结果，图4 c图为WMT组在添加了外泌体的培养基在成纤维细胞周期检测结果，图4d图为周期检测结果的统计学分析结果，其结果显示外泌体生物制剂可促进成纤维细胞S期的升高，可促进细胞的增殖。[0059]图5a为不同保存温度下，外泌体在不同的时间点在促进细胞增殖方面的检测结果，图5b为在不同保存下保存1个月，外泌体在促进细胞增殖方面的检测结果，结果显示该

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保存液可在不同温度储存下保持外泌体的活性。

[0060]以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

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