４６８８ 重庆医学２０１６年１１月第４５卷第３３期 ・技术与方法・ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１—８３４８．２０１６．３３．０２６ 双重实时荧光ＲＴ—ＰＣＲ法检测肠道病毒方法的建立及应用 许联红 ，岳玉林 ，王永仿 ，楚 鹰 ，蒋立新 （１．江苏大学附属武进医院检验科，江苏常州２１３００２；２．江苏省南京市儿童医院检验科２１０００８） ［摘要］ 目的 建立检测肠道病毒（ＥＶ）和肠道病毒７１型（ＥＶ７１）的双重实时荧光ＲＴ—ＰＣＲ法。方法 设计特异性引物和 探针，建立双重实时荧光ＲＴ—ＰＣＲ反应体系，绘制标准曲线，对该方法的灵敏度、精密度等进行评价。收集１０９例临床手足口病患 者粪便和咽拭子标本用该法进行检测，并与ＥＶ７１商品化试剂盒检测结果进行比较。结果 双重荧光ＰＣＲ法建立的ＥＶ和 ＥＶ７１标准曲线相关系数（，）均为０．９９８；该法检测ＥＶ和ＥＶ７１的灵敏度分别达到０．５ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ和０．０５ ＴＣＩＤ￣。／ｍＬ；检测ＥＶ 和ＥＶ７１的批内精密度均小于３ ，总精密度均小于或等于４ ；对肠道病毒及其他人类非肠道病毒进行检测，显示了良好的特异 性。１０９例临床样本用该法检测出８４例ＥＶ病毒阳性样本，其中ＥＶ７１阳性５６例，ＥＶ７１总阳性率为５１．４Ｖ０；与单重荧光ＰＣＲ商 品化试剂盒的检测结果完全一致（Ｐ一１．ｏｏｏ）。结论建立的双重实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法灵敏度高、稳定性好，对手足口病的早期 高通量快速诊断具有重要意义。 ［关键词］手足口病；肠道病毒；肠道病毒７１型；双重实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ ［中图分类号］ Ｒ５１２．５；Ｑ９３—３３ ［文献标识码］ Ａ ［文章编号］ ｌ６７１ ８３４８（２０１６）３３—４６８８—０３ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｕａｌ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＲＴ—ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ Ｘｕ Ｌｉａｎｈｏｎｇ ，Ｙｕｅ Ｙｕｌｉｎ。，Ｃｈｕ Ｙｉｎｇ ，Ｗａｎｇ Ｙｏｎｇ ｇ ，Ｊｉａｎｇ Ｌｉｘｉｎ （１＿Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａ ｌｉａｔｅｄ Ｗｕｊｉｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｊｉａｎｇｓｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２１３００２，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮａＲｊｉｎｇ Ｍｕｎｉｃｉｐａｌ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２１０００８，Ｃｈｉｎａ） ＥＡｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｄｕａｌ ｒｅａｌ—。ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＲＴ－ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ（ＥＶ）ａｎｄ ｅｎ—＿ ｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ７ １（ＥＶ７ １）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｂｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｕａｌ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＲＴ—ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｗａｓ ｄｒａｗｎ；ｉｔｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ．Ｆｅｃｅｓ ａｎｄ ｔｈｒｏａｔ ｓｗａｂ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｏｆ．１０９ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈａｎｄ ｆｏｏｔ ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ＥＶ７ １ ＰＣＲ ｋｉｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ（２）ｏｆ ＥＶ ａｎｄ ＥＶ７１ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｄｕａｌ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＲＴ－ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｂｏｔｈ ０．９９８．Ｉｔｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｒｅａｃｈｅｄ ０．５ ＴＣＩＤ５ｏ／ｍＬ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＥＶ ａｎｄ ０．０５ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＥＶ７１．Ｔｈｅ ｗｉｔｈｉｎ－ｒｕｎ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＥＶ ａｎｄ ＥＶ７１ ｗａｓ ＜３ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ≤４ ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｇｏｏｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｎｏｎ－ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ．Ｉｎ １０９ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｃｌｉｎｉｃａ１ ｓａｍｐｌｅｓ．８４ ｃａｓｅｓ ｏｆ ＥＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ，ｉｎ ｗｈｉｃｈ ５６ ｃａｓｅｓ ｗｅｒｅ ＥＶ７１ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｐｏｓｉ— ｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ ５ １．４ ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＲＴ—ＰＣＲ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐ １．０００）．Ｃｏｎｃｌｕ－ ｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｄｕａｌ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＲＴ－ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｇｏｏｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｗｈｉｃｈ ｈａｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｈａｎｄ ｆｏｏｔ ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ． ［－Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ￣ｈａｎｄ ｆｏｏｔ ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ；ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ；ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７ １；ｄｕａ１ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＲＴ—ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ 手足口病（ＨＦＭＤ）是一种急性传染病，由多种肠道病毒引 断提供一种有效、快速的检测手段。 起，多发生于５岁以下儿童，主要通过密切接触或消化道传播， １资料与方法 基本临床表现为手、足、口腔等部位出现疱疹，部分患者可引起 １．１ 一般资料 收集２０１４年３月至２０１５年８月南京市儿童 心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等多种与神经系统相关的疾 医院住院ＨＦＭＤ患儿的１０９份治疗前标本（粪便标本６４份和 病ｌ１］。个别重症患儿病情发展很快，最终可能导致死亡。引发 咽拭子４５份）。ＨＦＭＤ诊断标准参考中华人民共和国卫生部 ＨＦＭＤ的２Ｏ多种肠道病毒中以ＥＶ７１型最为常见。１９６９年 制定的２０１０年版《手足口病诊疗指南》。ＥＶ７１／ＦＹ０８０５和 Ｓｃｈｍｉｄｔ等 首次从加利福尼亚州患有中枢神经系统疾病的 ＥＶ７１／ＢｒＣｒ病毒株由南京大学公共卫生中心实验室提供。 婴儿粪便标本中分离出肠道病毒７１型，属于小ＲＮＡ病毒科 １．２仪器与试剂病毒核酸提取试剂盒（江苏硕世公司），一 肠道病毒属。ＥＶ７１病毒主要通过粪一口传播，且隐性感染者居 步法荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒（大连宝生物公司），ＡＢＩ７５００荧 多，因此易出现暴发流行 。］。该病已被我国定为乙类传染病。 光ＰＣＲ仪（美国ＡＢＩ公司），肠道病毒７１型核酸检测试剂盒 快速、简便、高敏感性的检测方法对该病的预防控制极其重要。 （中山大学达安基因公司）。 传统的病毒分离培养、血清学方法等，步骤繁琐，灵敏度不高， 根据ＥＶ７１的ＶＰ１区核酸序列和ＥＶ的５ ＵＴＲ区核酸序 容易出现漏检。本试验拟通过建立一种双重实时荧光ＲＴ— 列，用Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ３．０软件设计特异性引物与ＴａｑＭａｎ探 ＰＣＲ方法，在完全闭管的条件下同步检测通用型肠道病毒 针，并对其进行ＢＬＡＳＴ序列比对，验证引物和探针的特异性。 （ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ，ＥＶ）和ＥＶ７１病毒，为临床ＨＦＭＤ患者的早期诊 引物和探针序列见表１，均由上海生物工程公司合成。 ＊ 基金项目：江苏省武进市科技发展计划（ＷＳ２０１３１２）。 作者简介：许联红（１９８１一），硕士，主管技师，主要从事病原体分子生物学研究。 重庆医学２０１６年１１月第４５卷第３３期 表１ 引物和探针序列 ４６８９ １．３方法 １．３．１病毒核酸的提取粪便标本须加入适量生理盐水（０．５ ｇ粪便或０．５ ｍＬ液态粪便样本加５ ｍＬ生理盐水），然后将悬 液１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取２００ Ｌ上清液进行ＲＮＡ抽 提；咽拭子标本中加入１ ｍＩ 生理盐水充分搅动１Ｏ次，取２００ Ｌ提取ＲＮＡ；病毒细胞培养物直接取２００ Ｌ培养液用于抽 提ＲＮＡ。取上述各种标本２００ ｆｆＬ于１．５ ｍＬ离心管中，加入 ６００ Ｌ裂解液，震荡混匀，室温放置５ ｒａｉｎ；加入６００ Ｌ缓冲 液震荡混匀，混合液转移至吸附柱中，１２ ０００ ｒ／ｒａｉｎ离心１ｉ ｍｉｎ，去掉废液，重复此操作直至转移完；加入５００ Ｌ漂洗液， １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１ ｍｉｎ，去掉废液，重复漂洗１次；１２ ０００ ｒ枷／ 舶ｍｉｎ空柱离心２ ｍｉｎ；将吸附柱放人１个干净的１．５ ｍＬ离心管 中，加入５Ｏ”Ｌ洗脱液静置５ ｒａｉｎ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１ ｍｉｎ收 获纯化的核酸溶液，一８Ｏ℃冰箱保存备用。 １．３．２双重荧光ＲＴ—ＰＣＲ检测方法的建立 反应体系：２× ＰＣＲ缓冲液１２．５ Ｌ，５ Ｕ／ｕＬ Ｅｘ Ｔａｑ酶０．５ Ｌ，５ Ｕ／ｕＬ逆转 录酶（Ｍ—ＭＬＶ）０．５ Ｉ ，２０／￣ｍｏｌ／Ｌ上、下游引物各０．５ ｆｆＬ，１０ ｍｏｌ／Ｌ探针０．５ ｆｆＬ，总ＲＮＡ ５ Ｌ，ＤＥＰＣ水补足至２５ Ｌ。 扩增条件：５Ｏ℃３０ ｍｉｎ；９５℃５ ｍｉｎ；９５℃１０ Ｓ，５５℃３５ Ｓ， 共４５个循环，在５５℃进行双重荧光信号检测。 １．３．３ 双重荧光ＲＴ—ＰＣＲ法的灵敏度检测 将ＥＶ７１／ ＦＹ０８０５病毒株培养液（病毒滴度为５Ｘ１０ ＴＣＩＤｓ。／ｍＬ）１０倍 连续稀释（５～０．００５ ＴＣＩＤｓ。／ｍＬ），提取病毒ＲＮＡ，按上述条 件进行荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ，每个稀释标本重复检测１Ｏ次。 １．３．４双重荧光ＲＴ ＰＣＲ法的精密度检测 每天分析１个批 次，２个浓度样本（５Ｘ１０。和０．５ ＴＣＩＤｓ。／ｍＬ），每个样本重复 测定３次，连续检测５ ｄ。参照文献Ｅ５］计算批内精密度（ＣＶ批 内）和总精密度（ＣＶ总）。 １．３．５双重荧光ＲＴ—ＰＣＲ法的特异度检测 应用双重荧光 ＲＴ－ＰＣＲ法分别检测ＥＶ７１病毒株、柯萨奇病毒Ａ１６、埃可病 毒、轮状病毒和流感病毒。 １．３．６双重荧光ＲＴ—ＰＣＲ法的临床应用 应用双重荧光ＲＴ— ＰＣＲ法检测收集的１０９例ＨＦＭＤ患者粪便和咽拭子样品，并 与肠道病毒７１型核酸检测试剂盒检测结果进行比较。 １．４统计学处理 采用ＳＰＳＳ１７．０统计软件进行统计分析， 计数资料用四格表资料的 检验，以Ｐ＜０．０５为差异有统计 学意义。 ２ 结 果 ２．１ Ｅｖ和ＥＶ７１标准曲线建立 将ＥＶ７１／ＦＹ０８０５病毒株 培养液以１ｏ倍连续稀释，提取病毒中的核酸（ＲＮＡ）作为模 板，按上述条件进行双重实时荧光ＲＴ—ＰＣＲ反应，分别得到相 应荧光信号的ＥＶ和ＥＶ７１特异性扩增曲线，见图１。然后建 立相对定量标准曲线，其中横坐标为病毒滴度的ｌｏｇ值，纵坐 标为ＲＴ—ＰＣＲ循环的ｃ￡值，ＥＶ和ＥＶ７１标准曲线的相关系数 （ｒ）均为０．９９８，见图２。 ２．８ｅ＋０６ 一１ ２ ， ．． ！。 －． Ｄ ／ ／ ｆ 。厂 ：：＝ ；；； 一＿ ．－一． ｄ ／ ． ，， 一一 嚼米粼 ｜ ｜， ’／ 一一 ＿—一 一 一一，一 一 ８ ４ ｎ ４ ． 秭一 埘 ＝拿 咖 ＝一旱 ｛ ‘／ｌ．， 。 １ ／。 －．， ０，。 ｆ ｇ｝ １ 循环数 ＥＶ７１扩增曲线（ａ：５×１０ ＴＣＩＤ５。／ｍＬ，ｂ：５×１０。ＴＣＩＤ５ｏ／ｍＩ ，Ｃ：５ ×１０ｚ ＴＣＩＤ５。／ｍＬ，ｄ：５０ＴＣＩＤ５。／ｍＩ ）。ＥＶ扩增曲线（ｅ：５×１０ ＴＣＩＤ５。／ｍＬ，ｆ：５×１０。ＴＣＩＤ５ｏ／ｍＬ，ｇ：５×１０ ＴＣＩＤｓｏ／ｍＬ，ｈ： ５ＯＴＣＩＤ５ｏ／ｍＬ）。 图１ ＥＶ和ＥＶ７１双重荧光ＰＣＲ扩增曲线图 图２ ＥＶ７１和ＥＶ标准曲线的建立 ２．２双重荧光ＲＴ—ＰＣＲ法的灵敏度 当病毒滴度为５和０． ５ＴＣＩＤ５。／ｍＬ时，１Ｏ次ＥＶ和ＥＶ７１均能检出；当滴度为０．０５ ＴＣＩＤ 。／ｍＬ时，１Ｏ次中有２次ＥＶ未检出，ＥＶ７１全部检出；而 当滴度为０．００５ ＴＣＩＤ５。／ｍＬ时，ＥＶ均未检出，ＥＶ７１有１次 未检出。因此该方法检测ＥＶ和ＥＶ７１的灵敏度分别为０．５ 和０．０５ ＴＣＩＤ５ｏ／ｍＬ。 ２．３ 双重荧光ＲＴ－ＰＣＲ法的精密度 病毒滴度为５×１０ ＴＣＩＤ 。／ｍＥ时，Ｅｖ７１和ＥＶ检测所获得的Ｄ值批内精密度 （ＣＶ批内）分别为２．１ 和２．４ ，总精密度（ＣＶ总）均为３．９ ； 病毒滴度为０．５ ＴＣＩＤｓ。／ｍＬ时，ＥＶ７１和ＥＶ的批内精密度分别 为２．７ 和２，６ ，总精密度分别为４．０ 和３．５Ｖｏ，见表２。 ２．４双重荧光ＰＣＲ法的特异度 ＥＶ７１／ＦＹ０８０５和ＥＶ７１／ ＢｒＣｒ病毒株通用型ＥＶ和ＥＶ７１检测结果均为阳性；柯萨奇病 毒Ａ１６和埃可病毒Ｅｖ检测阳性，ＥＶ７１结果阴性；而轮状病 毒和流感病毒二者皆为阴性，见表３。 ． ４６９０ 表２ 重庆医学２０１６年１１月第４５卷第３３期 双重荧光ＲＴ－ＰＣＲ法的精密度检测（ｃ￡值） 表３ 双重荧光ＰＣＲ法的特异度检测 测已开始广泛使用分子生物学技术，普通的ＲＴ－ＰＣＲ技术虽然 克服了以上缺点，已经成为快速诊断的重要手段，但ＰＣＲ后需 进行凝胶电泳分析，且系统开放，容易受环境因素发生交叉污 染，造成假阳性，对疾病的诊断造成误诊＿１ ］。 本研究建立的双重实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ检测方法，利用 ＋：阳性；一：阴性。 ＴａｑＭａｎ技术，改善了单重荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ耗时长，成本高 和多重高通量ＲＴ—ＰＣＲ易发生污染、灵敏度和特异性较低的 不足ｌ＿１ 。该检测方法能在一个反应管中灵敏、特异地检测并 区分ＥＶ和ＥＶ７１。ＥＶ７１属于ＥＶ的一个亚型，利用ＲＴ ＰＣＲ 检测ＥＶ７１时，理论上不仅仅特异性的ＥＶ７１探针应该呈现阳 性曲线，ＥＶ的通用型ＥＶ探针也应该呈现阳性曲线，最后结 果应该显示为双阳性曲线。若是在检测ＥＶ７１时仅仅只有特 异性ＥＶ７１探针显示阳性而ＥＶ探针显示为阴性时，则该样本 ２．５ 双重荧光ＲＴ—ＰＣＲ法的临床应用 对１０９份临床 ＨＦＭＤ患者样品（其中粪便标本６４份，咽拭子标本４５份）利 用双重荧光ＲＴ＿ＰｃＲ和ＥＶ７１单重荧光ＰＣＲ商品化试剂盒进 行检测。通用型ＥＶ病毒在粪便中检出阳性５２例，咽拭子中 检出３２例，总阳性率为７７．１ （８４／１０９）。粪便和咽拭子标本 的ＥＶ７ｌ阳性率分别为５６．２５ （３６／６４）和４４．４ （２０／４５）。 双重荧光ＲＴ—ＰＣＲ法和ＥＶ７１荧光ＰＣＲ试剂盒检测ＥＶ７１总 阳性率均为５１．４ （５６／１０９），阳性和阴性符合率均为ｉｏｏ ， 检测结果完全一致（Ｐ一１．０００），见表４。 表４ 双重荧光ＰＣＲ法和单重荧光ＰＣＲ试剂盒 检测ＥＶ７１的结果比较 需重新进行检测。而对于ＥＶ阳性ＥＶ７１阴性的标本提示患 者是由其他肠道病毒引起，为明确病因需进一步进行其他肠道 病毒检测。 本研究结果显示，双重荧光ＰＣＲ法建立的ＥＶ和ＥＶ７１ 标准曲线相关系数均为０．９９８；检测ＥＶ和ＥＶ７１的灵敏度高， 分别达到０．５ ＴＣＩＤｓ。／ｍＬ和０．０５ ＴＣＩＤｓ。／ｍＬ；重复性好，批 内精密度均小于３ ，总精密度均小于或等于４ ；特异性检测 显示只有ＥＶ７１样本呈现ＥＶ和ＥＶ７１双阳性曲线，其他病毒 标本均未出现特异性ＥＶ７１阳性曲线，表明该法特异性强。ｆ临 床样本检测结果显示，双重荧光ＲＴ—ＰＣＲ法通用型ＥＶ阳性检 出率为７７．１ ，ＥＶ７１总阳性率为５１．４％，与ＥＶ７１商品化试 剂盒的检测结果完全一致（Ｐ一１．ｏｏｏ）。以上结果表明双重荧 ＋：阳性；一：阴性。 光ＲＴ—ＰＣＲ法可以对ＥＶ和ＥＶ７１进行稳定可靠的检测。 本研究建立的双重实时荧光ＲＴ—ＰＣＲ法检测肠道病毒快 ３讨 论 捷，灵敏度高，稳定性好，污染小，省时省力，能够有效检测手足 口病患者感染的病原体，也可进行大规模流行病学调查。 参考文献 传统的检测ＥＶ７１病原体的方法有病毒分离培养、血清学 方法和ＲＴ—ＰＣＲ等。病毒分离培养是手足口病感染的实验室 诊断金标准，但对实验室条件和操作人员技术要求严格，培养 周期长，各个实验室分离阳性率不同，病毒流行期间，不能同时 处理大量样本ｌ６ ］。中和抗体检测费时、费力，无法满足快速、早 期诊断的要求。酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）法可以检测相应病 ［１］Ｙａｎｇ ＴＴ，Ｈｕａｎｇ ＬＭ，Ｌｕ ＣＹ，ｅｔ ａ１．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｕｎｆａｖｏｒａｂｌｅ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｆｏｒ ｎｏｎ—ｐｏｌｉｏ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｔａｉ— 毒特异性ＩｇＭ抗体，操作简便、特异、准确，适用于早期检测，但 在检测低水平抗体时易出现假阴性，报道称其和ＲＴ－ＰＣＲ方法 联合检测有助于提高ＨＦＭＤ的早期诊断＿８ 。病原微生物检 ｗａｎ，１９９４—２００３［Ｊ］．Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ，２００５，３８ （６）：４ｌ７－４２４． ［２］ Ｓｃｈｍｉｄｔ ＮＪ，Ｌｅｎｎｅｔｔｅ ＥＨ，Ｈｏ ＨＨ．Ａｎ（下转第４７４１页） 重庆医学２０１６年Ｉ１月第４５卷第３３期 论，并能在课内及时完成平台上的单元测试题。学生对知识的 ４７４１ ｌｉｍｉｎａｒｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｓｅｌｆ—ｒａｔｉｎｇ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ 学习不再停留在简单的书本知识掌握与理解上，而是进一步开 始运用相关知识解决问题ｌｌ９］，学生学习的主动性得到了充分发 挥。课堂中引入典型案例进行讨论，活跃了课堂气氛，激发了 ｓｅｌｆ—ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｎｕｒｓｉｎｇ ｓｔｕｄｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｎｕｒｓ Ｓｔｕｄ，２０１０，４７（９）：１１５２—１１５８． ２２］秦桂英，朱葛俊．高职院校推行“翻转课堂”教学模式的条 件研究ＥＪ］．职教通讯，２０１４（１８）：５０—５２． ［３］杨翔，沈军．网络教学平台对护理本科学生自主学习能力 的效能研究［Ｊ］．重庆医学，２０１２，４１（２８）：３００５ ３００７． ［４］沈王琴，胡雁，史亚琴，等．护理专业本科学生自我导向学 习能力现状及相关因素分析ＶＪ］．中华护理杂志，２０１２，４７ （２）：１３２—１３５． 学习兴趣，培养了学生的创造能力及分析解决问题的能力，提 高了学习效果ｌ１ 。（２）从观察组学生对利用课程平台开展翻 转课堂教学的评价问卷结果看，学生们对外科护理翻转课堂的 教学方式，基本持肯定支持态度，平均支持率高达８５．７ ，特 别在“养成了课前主动学习的习惯”、“增强了外科护理课堂的 趣味性”、“提高了学生的课堂参与度”三方面支持率高达 ８９．８ 以上，学生们普遍认为该教学方式加深了对外护知识和 技能的理解、掌握和巩固，切实促进了外科护理的学习。 Ｆ－ｓ］隋树杰，仰曙芬，于方，等．护理学专业网络教学平台应用 效果分析＿Ｊ］．护理研究，２０１５，２９（２）：４８９—４９１． ［６］刘俊香，杨柳清，丁洪琼．“微课”视频在高职高专《急救护 ３．４基于课程平台的翻转课堂教学模式有待改进之处 （Ｉ） 翻转课堂教学模式目前已较成功地应用于外科护理理实一体 课，但尚未在以理论为主的教学单元中成熟应用，这是由于以 理论为主的教学单元在微课制作上以录播形式为主，缺乏生动 性，难以吸引学生主动进行课前学习，又由于其内容具有高度 概括性，在课堂上难以就具体外科病例展开讨论，翻转课堂实 施效果欠佳。因此，今后应加强研究外护理论与临床实际在教 学中的深度融合。（２）翻转课堂的全员参与度仍有不足。观察 组仍有６ 的学生未按照翻转课堂的要求及时进入课程平台 进行课前学习，课堂内很少主动参与讨论。这少部分学生需引 理技术》教学中的应用［Ｊ］．重庆医学，２０１４，４３（３３）：４５５７— ４５５８． ［－７１田志娟，金瑞华，刘春风．翻转课堂在老年护理学教学中 的应用研究ＬＪ］．中华护理教育，２Ｏｌ５，１２（５）：３３３—３３５． ［８］张金磊，王颖，张宝辉．翻转课堂教学模式研究［Ｊ］．远程 教育杂志，２０Ｉ２，３０（４）：４６—５ｉ． ［９］张春梅，金昌德．翻转教学设计在急救护理学教学中的应 用研究［Ｊ］．中华护理教育，２０１５，１２（４）：２５９—２６３． ，１１０］钟正伟，刘丹丹，唐旖旎．外科护理教学中引入典型案例 的应用研究＿Ｊ］．重庆医学，２０１４，４３（１４）：１８１５－１８１６． （收稿日期：２０１６－０５—１０修回日期：２０１６—０６—２８） 起高度关注，其参与度低的原因有待进一步调查分析。 参考文献 Ｅｌｉ Ｃｈｅｎｇ ＳＦ，Ｋｕｏ ＣＬ，Ｌｉｎ ＫＣ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅ一 （上接第４６９０页） ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ ｎｅｗ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＿Ｊ］．Ｊｐｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２０１４，６７（５）：３３３—３３８． ［８］谢靖婧，杨桂林，刘映霞，等．肠道病毒７１型手足１２１病 ＥＬＩＳＡ诊断试剂盒研制与临床应用［Ｊ］．中华检验医学杂 志，２００９，３２（１１）：１２６２—１２６５． ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， １９７４，１２９（３）：３０４—３０９． ｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ［３］ Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｚｈｕ Ｚ，Ｙａｎｇ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ａｎ ｅｍｅｒｇｉｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ２００８ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｈａｎｄ ｆｏｏｔ ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｆｕｙａｎｇ ｃｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎａ ［９］吕园园，徐家丽．手足Ｖ１病引起免疫学变化及实验室诊断 ［Ｊ］．细胞与分子免疫学杂志，２０１２，２８（１０）：ｌ１１４一ｌ１１６． ｒ１Ｏ］Ｗａｎｇ Ｙ，Ｚｏｕ Ｇ，Ｘｉａ ＡＭ，ｅｔ ａ１．Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｈａｎｄ，ｆｏｏｔ，ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｓｈａｎｇｈａｉ， ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌ Ｊ，２０１０，７（１）：９４． ｕ ＳＬ，Ｐａｎ Ｈ，Ｌｉｕ Ｐ，ｅｔ ａｉ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ［４］ Ｌｉａｎｄ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｏｆ ｆａｔａｌ ａｎｄ ｎｏｎｆａｔａｌ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｈａｎｄ，ｆｏｏｔ ａｎｄ Ｃｈｉｎａ：ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ［Ｊ］． Ｖｉｒｏｌ Ｊ，２０１５，１２（１）：８３． ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｍａｉｎｌａｎｄ Ｃｈｉｎａ ｆｒｏｍ ２００８ ｔｏ ２０１４［Ｊ］． Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ，２０１５，２５（２）：１１５ １２８． ［１１］许玉玲，黄学勇，卫海燕，等．实时荧光ＲＴ—ＰＣＲ与普通 ＲＴ—ＰＣＲ检测手足口病病原体的比较分析［Ｊ］．中国病原 生物学杂志，２０１１，６（１０）：７３６—７３８． ［５］ 王薇，王治国，李少男．临床实验室对厂家声明的精密度 和真实度的性能验证要求［Ｊ］．检验医学，２０１０，２５（１２）： １ＯＯ１—１ＯＯ５． ，１１２］Ｊｉａｎｇ Ｂ，Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｙｏｕ ｘ，ｅｔ ａ１．Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｈａｎｄ，ｆｏｏｔ， ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＥＶ７ １ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ— ＭＨ，Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｔ，Ｐｏｄｉｎ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒ— ［６］ ０ｏｉｅｎｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ ｔｙｐｅｓ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒ— ｅｓ ｂｙ ａ ｏｎｅ—ｓｔｅｐ，ｓｉｎｇｌｅ ｔｕｂｅ，ｄｕｐｌｅｘ ＲＴ—ＰＣＲ［Ｊ］．Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ，２０１２，８４（１１）：１８０３ １８０８． ｕｓ ７１一ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈａｎｄ—ｆｏｏｔ—ａｎｄ—ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００７，４５（６）：１８５８－１８６６． ，１１３］Ｈｗａｎｇ Ｓ，Ｋａｎｇ Ｂ，Ｈｏｎｇ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｄｕｐｌｅｘ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ Ｒ ｒ＿ＰＣＲ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｔａｑｍａｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｄｅ— ＪＤ，Ｔｓａｉ ＨＪ，Ｌｉｎ ＴＨ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃ— ［７３ Ｔｓａｉｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｏｆ ＲＴ—－ＰＣＲ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｍｂｉｎａ—－ ｔｅｃｔｉｎｇ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｐａｎ—ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１［Ｊ］．Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ，２０１３，８５（７）：１２７４—１２７９． （收稿日期：２０１６－０５—１１修回日期：２Ｏ１６—０７—２１） ｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｆｒｏｍ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏ— ｃｉａｔｅｄ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｄｕｒｉｎｇ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７ １ ｅｐｉｄｅｍｉｃ
