水豆豉中高产豆豉纤溶酶的菌株筛选、鉴定及生长性能研究

鉴定及生长性能研究董科1!,陈宇航1!,沈丹芸1!,裴晓方1!*(1.四川大学华西公共卫生学院(华西第四医院)，成都610041 &.食品安全监测与风险评估四川省重点实验室，成都610041)摘要：采用平板法初筛，从市售水豆豉分离细菌中筛选得到6株具有高产蛋白酶、淀粉酶和豆豉纤溶酶

的菌株；经化学法复筛，获得1株高产豆豉纤溶酶菌株B61。对B61菌株进行形态学、生理生化特性鉴

定及16S rDNA同源性分析,最后鉴定为贝莱斯芽砲杆菌(Bacillus velezensis)，且该菌株在生长16 h后

检测到最高豆豉纤溶酶活力(826. 25 IU/mL续相关研究提供了理论依据关键词：水豆豉；豆豉纤溶酶；筛选；菌种鉴定$

)。该研究丰富了豆豉纤溶酶产生菌的菌种资源，并为其后

doi：10. 3969%. issn. 1000-9973. 2019. 09. 017中图分类号:TS201. 57 文献标志码:A

文章编号：1000-9973(2019)09-0085-05Research on Screening, Identification and Growth Performanee of High-yield

Douchi Fibri no lytic En zyme Strain from Ferme nted Soybea nsDONG Ke1，, CHEN Yu-hang，, SHEN Dan-yun1，, PEI Xiao-fang12*(1. West China School of Public Health (West China Fourth Hospital) , Sichuan University,

Chengdu 610041, China；2. Key Laboratory of Food Safety Monitoring and Risk

AssessmentinSichuanProvince\"Chengdu610041\"China)Abstract：Six strains of high-yield protease , amylase and douchi fibrinolytic enzyme are screened from

the isolated bacteria of commercial fermented soybeans by plate method. A strain B61 with high-yield douchi fibrinolytic enzyme is screened from fermented soybeans by chemical method. The strain B61 is

identified as Bccillus velezensis by morphological , physiological and biochemical characteristics identification and

16S rDNA homologous analysis. The highest douchi fibrinolytic activity (826. 25 IU/mL) is detected

after growing for 16 h. This study has enriched the strain resources of douchi fibrinolytic enzyme producing bacteria , and provided theoretical basis for the follow-up related research.Key words: fermented soybeans ； douchi fibrinolytic enzyme ； screening ； strain identification豆豉纤溶酶（douchi fibrinolytic enzyme , DFE）是 我国学者从传统发酵食品豆豉中分离得到的一种丝 氨酸蛋白酶。有研究表明，该酶是一种新型纤溶

源的纤溶酶治疗血栓新型药物的研究开发受到世界 各国学者的重视。1987年，日本学者发现了大豆发酵食品纳豆中的

酶］ ,不仅具有半衰期长、纤溶活性高、安全无毒、口 服效率高等优点）231,还可弥补目前临床上治疗血栓 性疾病使用的溶栓剂如尿激酶和链激酶半衰期短、 成本高、效率低等不足⑷。因此,通过各种微生物来

收稿日期$019 — 02 — 21

11纳豆激酶具有高纤溶活性「51 ,后续研究更揭示了纳豆激 酶具有降血压、抗动脉粥样硬化、抗凝、神经保护等作

用「61 ,且相关保健品已在市面上进行销售；1996年，韩国 学者）71从本国传统发酵食品Chung Kook-Jang中分离

*通讯作者基金项目：四川省科技厅科技支撑项目（2016SZ0034）作者简介：董科（1995 — ）,男，四川资阳人，硕士研究生，研究方向：微生物与公众健康；裴晓方（19—）,女，四川绵阳人，教授，硕士，研究方向：微生物与公众健康。85第44卷第9期2019年9月中国调味品China Condiment进行比较。基础研究得到具有高活性的纤溶酶’而我国学者［8］也早在

1999年就从豆豉中分离到了豆豉纤溶酶，并对其进

豆豉纤溶酶初筛：接种菌株至肉汤，培养24 h,离

行了大量的研究工作，包括产酶菌株的筛选、产酶基 因克隆、豆豉纤溶酶的分离与纯化及溶血栓机制的 研究等）9。但是，目前分离得到的豆豉纤溶酶酶活 力低下和生产力水平不足制约着其进一步开发成为

心后吸取上清液8 #L滴加至纤维蛋白平板孔内。

37 '恒温培养箱孵育，16 h后测量垂直透明圈直径。

*根据尿激酶标准曲线得到菌株于肉汤中所产的豆豉纤 溶酶含量。1.4.3 菌株 酶能力溶栓药物。因此，通过豆豉纤溶酶高产菌株的筛选

等方式提高酶活力及产量成为突破现有研究瓶颈的 关键。选取初筛后产酶能力较强的菌株，根据相关标 准「10*中蛋白酶、淀粉酶的检测方法及文献［11］所述纤 本研究以市售水豆豉为原材料，采用平板法初筛

和化学法复筛相结合的方法，旨在筛选出1株活性较 高的豆豉纤溶酶产酶菌株，为将水豆豉及相关发酵产 品研发成具有溶栓作用的健康产品提供了备选菌株及 理论依据。1材料与方法1.1样品来源在四川、云南和贵州省收集11种水豆豉样品，收 集后的样品立即进行细菌分离培养，并将剩余样品存 于灭菌均质袋中，一80 '冰箱保存。1. 2主要试剂营养琼脂培养基、酪蛋白培养基和LB肉汤培养 基:均购于北京路桥技术有限责任公司；福林酚：购于 北京索莱宝科技有限公司；酪蛋白：购于中国食品药品 检定研究所；纤维蛋白原和凝血酶：购自Sigma公司；

尿激酶:购自Aladdin公司；可溶性淀粉、无水碳酸钠、

L -酪氨酸、柠檬酸等其他试剂：均为国产分析纯。13隔水式恒温培养箱上海飞跃实验仪器有限公司；

Multiskan GO酶标仪 赛默飞世尔科技公司；5430R低 温高速离心机 德国Eppendorf公司；HR40-- A2生物安 全柜青岛海尔特种电器有限公司；分子成像仪、Power

Pac Basic™ 电泳仪、C1000 TouchTM Thermal Cycler PCR

扩增仪 BIO-RAD公司。1.4 实验方法141 菌株分将获得的水豆豉样品在无菌条件下各取3 g并加 入营养肉汤，37 °C、150 r/min摇床增菌培养24h后， 在营养琼脂平板上划线分离，于37 '恒温培养箱培养

24 h,从平板中挑取形态、颜色不同（即可能为不同菌

种）的菌落于斜面培养基（营养琼脂）上保存，备用。1.4.2 菌株 酶能力蛋白酶、淀粉酶初筛：将复苏24 h后的菌株点种

于酪蛋白培养基和淀粉培养基上（淀粉酶初筛需要在 菌落周围滴加0）2 mol/L碘液），观察形成的透明圈， 记录透明圈直径与菌落直径，取透明圈直径/菌落直径

86维蛋白酶解法进行复筛。1））菌株常规鉴定根据《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）和《常用细菌

鉴定手册》（2001年）等所提及的方法对筛选出的高产 纤溶酶菌株进行生理生化特性鉴定。1）.5细菌gyrB基因测序鉴定及系统发育分析用直接水煮法提取细菌DNA,进行PCR扩增。细菌 gyrB 基因引物序列：UP2r: 5 ^AGCAGGGTACGGATGT-

GCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT3'； UP1： 5- GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAA RTTYGA3'，扩增片段长度为1200 bp。扩增体系为

（25 #L）：2XMix（包含 dNTP、Mg+ ‘Reaction Buffer、

Polymerase）为 12. 5 #L，上、下游引物（10 #mol/L）为 1.0 #L,ddHzO 为&5 #L,DNA 模板为 2 #L。扩增条

件：98 '预变性2 min；（98 ' 10 s,55 ' 10 s,72 ' 15 s）

35个循环;72 ' 5 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定

后送测序。测序结果经 Blast （http：/ /blast. ncbi. nlm, nih.

gov/Blast. cgi）进行核酸序列相似度比较,并使用Mega 6. 0

作系统进化树，选取遗传距离最近的种进行鉴定。

1.4.6细菌生长性能测定定的菌株 苏 2h 吸取一定 菌液，用酶标仪在600 nm下检测其OD值，至28 h结束，绘 制菌株的生长曲线；另每2 h吸取一定量菌液离心后

取其上清液，过0. 22 #m滤膜后检测豆豉纤溶酶含

量，至28 h结束，绘制菌株的产酶曲线。2结果与分析2. 1菌株产酶能力的初筛2.1.1蛋白酶、淀粉酶初筛结果从11份水豆豉样品中分离出79株细菌（B01〜

B79）。以透明圈直径/菌落直径为考察蛋白酶（4d）、

淀粉酶（2 d）能力的指标。79株细菌的测定结果见

表1,可见蛋白酶产酶率（9& 7%）高于淀粉酶产酶率

（83.5%）,且不同菌株产淀粉酶的能力较接近。其中，

两株细菌的产蛋白酶能力最高，其4 d透明圈直径/菌

落直径为7（B29、B49）,仅有1株菌不产蛋白酶或产酶

较少（B10）,无透明圈产生。第44 9期2019年9月中国调味品ChinaCondiment基础研究表1细菌产蛋白酶、淀粉酶能力初筛结果Table1Preliminaryscreeningresultsofprotease

andamylaseproductionabilityofbacteria酶类透

径/菌

径细菌数无透明圈11〜2212〜3313 〜414蛋白酶4 〜555 〜#63合计79酶98.7%无透131 〜253淀粉酶2 〜313合79酶83.5%酪蛋白平板的检测图见图1中a,b,除图1中b

左 的大肠杆菌标准株外，其余7株细菌均能 ：

同程度的蛋白酶。淀粉培养基的检测图见图1中c,

d,除图1中eg 株菌及图1中d右上角菌株外,

其余菌株均 粉酶。图1平板法产酶能力初筛Fig.1Preliminaryscreeningofenzymeproductionability

byplatemethod注：a,b为酪蛋白平板；c,d为淀粉培养基；e,f为纤维蛋白

平板。2.1.2豆豉纤溶酶初筛结果79株细菌 纤溶酶的测定结果见表2,产酶率为98.7%，不同菌株产酶能力 较大。其中有

29株细菌豆豉纤溶酶活性低于200 IU/mL,3株 [

纤溶酶活性高于4000 IU/mL(B03、B61、B62),活性最

高的为6728 IU/mL(B03),B10号菌株依然无透明圈o表2细菌产豆豉纤溶酶能力初筛结果Table2Preliminaryscreeningresultsofdouchifibrinolytic

enzymeproductionabilityofbacteria豆豉纤溶酶活性(IU/mL)细菌无透11〜20029200〜40015400〜6005600〜8005800〜100051000〜2000102000〜40006>40003合79酶98.7%纤维蛋白平板的检测图见图1中e, f。e为尿激酶标准溶液的溶解圈，f中除10号孔外，其余孔均有程度的 纤溶酶 o2, 2菌株产酶能力的复筛结果2, 2, 1 菌株选取中选取同时满足酪蛋白平板4 d透明

圈与菌株直径比&3,淀粉培养基透 菌株直径比&1,豆豉纤溶酶活力&1000 IU/mL的菌株：产

酶能力的

。共有6株细菌满足要求，分

B02、B17、B37、B61、B62、B70o2.2.2 菌株 酶能力菌株使用化学法

的 见表3o除了 B02与B37

性蛋白酶外，其余为中性蛋白酶。活性最高的前3个菌株分别为B02.B62.B61o 粉酶活性最高的菌株分别为B61.B17.B62o 纤溶酶能力咼的分

B61、B70、B02。

合菌株3 酶能力的情况，选择B61号菌株 面保存，并 菌定。表3细菌产酶能力复筛Table3 Rescreeningofenzymeproductionabilityofbacteria菌株编号蛋白酶(U/mL)粉酶(Abs)纤溶酶(FU/mL)B0228.290.013.13Bl 718,260.071.03B3712.620.030.15B6124.520.095.65B6227.060.052.32B705.580.034.97注：由于菌株产淀粉酶含量过低的酶浓度,

，附录中并不能查到相应

试 性对照孔的吸光度差值表示o值越大，代表酶浓度越高。87

第44 9期2019年9月中国调味品China Condiment基础研究2. 3 B61菌株的鉴定B61接种营养琼脂，37 '培养24 h后，菌落大小

67 KJ717950.1 Bacillus amyloliquefaciens JN 120859.1 Bacillus amyloliquefaciens

2. 3. 1菌株形态学鉴定94

61 JN6939.1 Bacillus sp.JN120860.1 Bacillus amyloliquefaciensKJ717949.1 Bacillus amyloliquefaciens约为0. 8 #mX 1. 2 #m,颜色呈乳白色不透明，形状最

93

JN086139.1 Bacillus amyloliquefaciensJQ734540.1 Bacillus amyloliquefaciens59 JQ734538.1 Bacillus amyloliquefaciens-----------------DQ309309.1 Bacillus amyloliquefaciens26为圆形，继而 液状分泌物。

镜

始褶皱 ，挑开菌 有粘菌体呈杆状，革兰染色反iJN859130.1 Bacillus amyloliquefaciens91 IjN859131.1 Bacillus amyloliquefaciens阳性，结果见图2。b图2

B61形态学鉴定Fig. 2 Morphological identification of strain B61 注：a为菌落形态；b为显微镜下革兰染色图(X1000)。2. 3)菌株生化反应鉴定B61 菌株 芽 杆菌、 解 粉芽 杆菌标准

菌及贝莱斯芽抱杆菌对照，包括形态、生理、生化，结果 见表4。

《, 细菌鉴定手册》及文献中 1213， 溶血 阳性

其 于枯芽抱杆菌,符合解淀粉芽抱杆菌和贝莱斯芽抱杆菌的

特点。 证明，贝莱斯芽抱杆菌作为解淀粉芽抱杆菌的同物异名菌，二者亲

较近(74%〜%),暂无法区分。

，B61菌株

定为解淀粉芽抱杆菌 莱 芽 杆菌。表4 B61菌株的生理生化特性Table4PhysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofstrainB61菌株v-p + X盐淀粉明k n XX

EE L-

盐

E D 7% VpH5)

溶血生长

水解液化利用，利用X丨 甘露cXV产XX长长反应B61-++ + +-+++++++芽杆菌

-++ + +-++++++-解淀粉芽 -++ - +++++++++杆菌莱斯芽 -++ + +++++++++杆菌2)) gyrB基因测序结果B61 菌株 定 为解 粉芽 杆菌 莱 芽

杆菌，选择gyrB 片段扩增测序，再度 分。序 Blast对比 度高的 菌株 :树，见图3。可见B61

莱斯芽抱杆菌的亲比较近，故鉴定为贝莱斯芽抱杆菌(Bacillus

velezensis)。—88 —59

CP014990.1 Bacillus velezensisCP017775.1 Bacillus velezensis6

分离菌株68747.1 Bacillus velezensis92KX912275.1 Bacillus amyloliquefaciensKX668385.1 Bacillus amyloliquefaciensKY315726.1 Bacillus amyloliquefaciens-------------------JQ734539.1 Bacillus amyloliquefaciens 0.001图3

B61与参考菌株的系统进化树Fig. 3 Phylogenetic tree of strain B61 and reference strains2) B61 曲线及产酶曲线为了考察B61菌株的生长能力及产酶能力，绘制 其生长曲线及产酶曲线，结果见图4。可见菌株生长

2 h 入 期，生长14 h

入稳定期，18h后进入 期。菌株生长6 h后可检测到 纤溶酶活性,生长到16 h时酶活性达到最高，为826. 25 IU/mL, 而稳定至20 h，

。产酶曲线 长曲线具有一定的

性-生长曲线 产酶曲线□「1.01

0800

O

图4 B61的生长曲线与产酶曲线Fig. 4 Growth curve and enzyme production curve of strain B613 讨论收集云、贵、川地区水豆豉为原材料，利

用 培养

分离菌株 酶能力的平板法发现细菌产蛋白酶、淀粉酶、豆豉纤溶酶的比例

分别为98. 7%、83. 5%、98. 7%。 中

酶能力较强的6株菌 学法 ，得到产酶能力最强的菌株B61,经鉴定为贝莱斯芽抱杆菌。该菌是Ruiz-

Garcia等口5**于2005年 名的芽抱杆菌种， 被Wag等「16确定为解淀粉芽抱杆菌的后期异型体。所

莱斯芽抱杆菌与解淀粉芽抱杆菌的亲缘性较近,

但 见能将二者分开的 标准，第八版的

第44卷第9期2019年9月中国调味品China Condiment基础研究伯杰细菌手册中，也未见具体描述贝莱斯芽抱杆菌的 生化反应。Fan B等〔17*于2007年提出贝莱斯芽抱杆菌 与解淀粉芽抱杆菌在ANI和dDDH上的区别是在区分 物种的界值以下的，所以建议都纳入解淀粉芽抱杆菌

[6*Chen H\"Mcgowan E M\"Ren N eLal.NaLokinase:apromising

alternative in prevention and treatment of cardiovascular diseases[J*.BiomarkInsights201813:918-920.[7*Kim W\"ChoiK\"Kim Y etal.PurifiGationandGharaGterization

组。因此，在GenBank中，贝莱斯芽抱杆菌和解淀粉芽 抱杆菌也均属于 Bacillus amyloliquefaciensHee C B 等「则对解淀粉芽抱杆菌组的3个菌种基因进行了分 析,发现贝莱斯芽抱杆菌富含次生代谢产物合成的相 关基因，也有更多参与抑菌化合物合成的基因目前关于贝莱斯芽抱杆菌产豆豉纤溶酶能力的相

„ ofafibrinolytiGenzymeproduGedfrom Bacilu-sp.strain CK 114 screened from Chungkook-Jang [J*. Applied & EnvironmentalMicrobiology 1996 62(7):2482%[8] 李江伟，冉国侠，陈新梅.豆豉溶栓酶的分离纯化及其体外

溶栓作用[J*.中国生化药物杂志，1999(3):148150.。[9] 沈畅萱，王修俊，黄珊.豆豉纤溶酶等微生物源纤溶酶的研

关发现较少，仅查看2019年Yao Z等〔19*从传统海鲜

发酵物中分离到1株产豆豉纤溶酶的贝莱斯芽抱杆

菌。在本研究中，该贝莱斯芽抱杆菌的生长曲线2〜

14 h为对数生长期。不同文献中同一种菌的生长曲

线略有差异，吴拥军等)20*报道枯草芽抱杆菌的对数生

长期为5\"10 h,解淀粉芽抱杆菌为2〜16 h,与贝莱 斯芽抱杆菌接近。张旭等报道解淀粉芽抱杆菌的豆豉 纤溶酶活性在2 h即能检测出，在24 h达到最大值,

而本研究中，6 h可检测到豆豉纤溶酶活性，16 h达到

最大活性,造成差异的可能原因是该文献采用的化学。

法，检出限相对于平板法较低4结论本研究采用平板法初筛和化学法复筛相结合的方

法,从四川、云南和贵州收集的11种市售水豆豉样品 中筛选出1株高产纤溶酶菌株B61,经过一系列生理 生化特征分析，并结合gyrB基因测序分析，鉴定其为 贝莱斯芽抱杆菌，且该菌株在16 h后检测到最高豆豉

纤溶酶活力，为826. 25 IU/mL。综上所述,B61菌株无论作为纤溶酶生产菌还是

水豆豉发酵菌株，均具有优良性能，也为进一步开发成 为溶血栓药物提供了生物菌株和数据参考。参考文献：[1]龚福明，柳陈坚，李海燕•豆豉纤溶酶的研究现状[J*生物

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