微生物鉴定中常用的生理生化试验
一、实验目的
1.证明不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2.掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5.了解IMViC的原理。
二、实验原理
由于各种微生物具有不同的酶系统，所以它们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体的原理如下：
1.淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种四种细菌（枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。
2.糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 3.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。
（1）吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。本次不做该试验。
（2）甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。
三、实验材料
1.菌种
大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球(Staphyloccocus aureus Rosenbach)，
铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Cohn）， 产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，普通变形杆菌（Proteus.vulgaris)。 2.培养基
固体油脂培养基，固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），乳糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基。 3.溶液和试剂
革兰氏染色用卢戈氏碘液，甲基红指示剂，乙醚和吲哚试剂，无菌水。
4.仪器和其他用品
平板，试管，接种环，试管架，电子天平，称量纸，玻璃棒，三角瓶，烧杯，药匙，标签纸，酒精灯，滴管。
表1相关培养基及其配制
培淀粉培养基 养基 配蛋白胨2g，方 NaCl1g，1g牛肉油脂培养基 蛋白胨水培养基 糖发酵培养基 葡萄糖蛋白胨水培养基 蛋白胨5g，葡萄蛋白胨2g，牛肉膏蛋白胨2g，1g ，NaCl1g香油或NaCl1g，蒸馏蛋白胨水培养基1000ml，1.6%溴甲酚糖5g，k2HPO42g紫乙醇溶液1~2ml，蒸馏水1000ml ，pH7.6，另配制葡萄糖pH7.0~7.2 （或乳糖）各10ml 见下面方法1.2.3.1 分装试管121℃灭菌20min 膏，0.4g可溶性淀花生油2g，1.6%的中水200ml，粉，蒸馏水200ml，性红0.2ml，蒸馏水pH7.6 琼脂3~4g 制121℃灭菌20min 备 四、实验步骤
200ml，琼脂3~4g 121℃灭菌20min 121℃灭菌20min 1淀粉水解实验
1固体淀粉培养基融化后冷却至50℃左右，无菌制作平板。平板底部划分为四部分。 2将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在不同的部分划线接种，在平板的反面分别写上菌名。将平板倒置在37℃温箱中培养48h。
3观察各种细菌的生长情况，打开平板的盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。观察。 2油脂水解实验
1将熔化的固体油脂培养基冷却至50 ℃左右时，充分振荡，使油脂均匀分布，无菌操作倒平板，待凝。用记号笔在平板底部划成四部分
2将枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌分别用无菌操作划十字接种于平板的相对应的部分的中心，分别标上菌名。将平板倒置，于37 ℃温箱中培养48h。 3取出平板，观察菌苔颜色。
3糖酵解实验
1制作糖发酵培养基
1将上述含指示剂的蛋白胨水培养基分装于试管中，在每个试管中放一个倒置的德汉式小管，使充满培养液。
2将已分装好的蛋白胨水和20%的各种溶液分别灭菌，蛋白胨水121℃灭菌20min；糖溶液112℃灭菌30min。
3灭菌后，每管以无菌操作分别加入20%的无菌糖溶液0.5ml。
2用记号笔在各试管外壁中分别标明发酵培养基的名称和所接菌种的名称。
3取葡萄糖培养基试管5支，两只接入大肠杆菌、两只普通变形菌，第五只对照。另取乳糖发酵培养基5支，做同样的处理。37℃培养48h后观察。 4吲哚实验
1将大肠杆菌和产气肠杆菌分别接入2支蛋白胨水培养基，置于37℃培养48h。
2向培养基中加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性。 5甲基红试验
1将大肠杆菌和产气肠杆菌分别接入2支葡萄糖蛋白胨水培养基，置于37℃培养48h。 2于葡糖糖蛋白胨水培养基的培养物内加甲基红试剂2滴。培养基变黄为阴性，红为阳性。
五、 实验结果 1结果记录
表2大分子水解实验结果记录
淀粉水解 油脂水解 大肠杆菌 - - 枯草芽孢杆菌 + - 铜绿假单胞菌 - + 金黄色葡萄球菌 - - 注：有水解圈产生为阳性（+），反之为阴性（-）。
表3糖酵解实验结果记录
糖发酵类型 葡萄糖发酵 乳糖发酵 大肠杆菌 + 没有结果 普通变形杆菌 + 没有结果 对照 - 没有结果 “+”产酸或产气，“-”不产酸或不产气 表4吲哚甲基红实验结果记录
甲基红实验 吲哚实验 大肠杆菌 + 没有结果 产气肠杆菌 - 没有结果 对照 - 没有结果 实验失败原因（甲基红&吲哚）：
2实验照片
结果分析
由大分子水解试验（图1和图2） 可以得出枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌能产生淀粉酶脂肪酶的结论，枯草芽孢杆菌菌落周围的透明圈较铜绿假单胞菌周围的透明圈大，可以大体判断前者较后者代谢利用淀粉的能力强。大肠杆菌能产生脂肪酶。
通过糖酵解实验（图3和图4）可看出大肠杆菌和普通变形菌都能够分解葡萄糖，但是普通变形菌不能够分解乳糖。
在吲哚试验中，大肠杆菌和产气肠杆菌都能具有分解色氨酸产生吲哚的能力
六、思考题
1．你怎么样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？
答：菌苔周围产生水解圈，可知淀粉在细胞外被水解，应该是细菌将淀粉酶分泌到胞外所致，因此为胞外酶。
2．不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？
答：淀粉水解为葡萄糖才能被细胞利用，因此可以换用斐林试剂。呈阳性者则说明产生了葡萄糖，淀粉被水解；阴性者说明淀粉未被水解。
3．假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？
答：由于产生的CO2溶于水的量少且碳酸酸性若，因此颜色不变化，仍为紫色。德汉氏小管中有气柱。
4．讨论IMViC试验在医学检验上的意义。
答：可以鉴别某些疾病是由大肠杆菌还是产气肠杆菌引起的。
5．解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？
答：某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚，是红色物质，便于观察。
七、实验小结
通过本次实验我们证实了不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统；了解了糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用以及IMViC的原理；并掌握了微生物大分子物质水解实验的原理和方法以及通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 ，
