丹参酚酸A、B对大鼠局灶性脑缺血损伤保护效应比较

丹参酚酸A、B对大鼠局灶性脑缺血损伤

保护效应比较

商洪才，曹红波，汪洋，张伯礼

天津中医药大学，天津（300193）

摘 要：目的 研究丹参酚酸A（salvianolic acid A, SalA）对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用及特点，比较丹参酚酸A和丹参酚酸B（salvianolic acid B, SalB）在此效应上的强弱，为SalA的研究开发提供实验依据。方法 利用线栓法制作SD大鼠左侧大脑中动脉阻塞（MCAO）模型，于苏醒时和术后24h进行神经行为学评分；24h评分后断头取脑测定脑梗塞指数、脑指数及脑含水量；应用HE染色观察SalA干预后缺血区病理学改变。结果 SalA可以改善MCAO大鼠神经功能缺损状态，缩小梗塞面积，减轻脑水肿，降低相关脑区神经元损伤程度。综合分析，SalA的作用体现出比SalB更明显的趋势，SalA三个剂量中以2.5mg·kg-1组效应更强。结论 针对脑缺血损伤，SalA的保护作用有优于SalB的趋势，而本实验中表明SalA的量效关系不明显。

关键词：丹参酚酸A；局灶性脑缺血；脑梗塞指数，脑含水量；神经行为评分

近年来，医药学界对丹参水溶性成分的关注日益增多，尤其是丹参酚酸类成分，自二十世纪80年代后期开始，经过近20年的努力取得了较丰富的研究成果，证明丹参酚酸在多方面表现出较强的药理活性，具有重要的理论价值和临床意义。

脑血管是丹参酚酸药理作用的主要靶点，而丹参酚酸A和丹参酚酸B是丹酚酸类成分中药理活性最强的两类[1]。二者化学结构相似，如丹酚酸A（salvianolic acid A，Sal A）是一分子丹参素与两分子咖啡酸缩合而成；丹酚酸B（salvianolic acid B，Sal B）为三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成（见Fig 1）。二者在脑缺血损伤保护效应上的比较未见报道，本研究旨在阐明这一问题，同时考察丹酚酸A在脑缺血损伤保护效应上是否存在量效关系。

图1 丹参酚酸A和丹参酚酸B的分子结构式

Fig 1 Structures of Sal A and SalB

1. 材料

（1）实验药品：丹酚酸A（沈阳药科大学提供）；丹酚酸B（沈阳药科大学提供）。 （2）实验动物：成年健康SD大鼠，雄性，体重260～300g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2002-0003。

（3）试剂：0.1%左旋多聚赖氨酸；0.9%生理盐水；10％水合氯醛；1％TTC溶液（AMRESCO分装）；10％甲醛溶液。

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（4）实验器械：必备剪、钳、针、线、微动脉夹等手术器械；37℃水浴箱，竹刀。

2. 方法

2.1模型复制

采用改良线栓法制备MCAO模型[2

，3]

。

线栓制备：采用直径0.28mm的鱼线（西原钓具有限公司产品），使用前仔细缠绕在载玻片上，60℃烘干1h，冷却后剪至每段4cm，前端用砂纸磨钝，尖端0.5cm蘸石蜡（蘸后直径约0.3mm），经0.1%多聚赖氨酸处理，备用。

模型制作：SD大鼠称重，按3.5ml•Kg-1腹腔注射10％水合氯醛麻醉，固定于手术台上，颈正中备皮、切口，暴露左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA），微动脉夹夹闭颈总动脉。沿颈外动脉依次钝性分离其分支：枕动脉、甲状腺上动脉和咽升动脉，使用电刀凝闭。双线结扎ECA远心端，从两结扎点中剪断，使颈外动脉残端游离，微动脉夹夹闭颈内动脉远心端，并于颈外残端预留结扎线备用。牵拉颈外动脉残端，在其起始部做楔形切口，由此插入准备好的鱼线（直径0.28mm），使之由颈外动脉通过分叉部进入颈内动脉，松开微动脉夹，轻推鱼线至大脑中动脉的起点，遇阻力停止（进线约18～20mm）。收紧结扎线，结扎颈外动脉及鱼线，剪断多余鱼线，松开颈总动脉微动脉夹，逐层缝合颈部切口，消毒。术中、术后室温严格控制在24~25℃，大鼠体温维持在36.5~37.5℃。

模型成功的标志：大鼠苏醒后出现同侧Horner征和对侧以前肢为重的偏瘫。

2.2分组设计

模型组（Model, iv, 生理盐水0.5ml·kg-1）

：不插入鱼线，其它同模型组 假手术组（Sham, iv, 生理盐水0.5ml·kg-1）

：模型＋给药 丹酚酸A组低剂量组（SalA, iv, 2.5mg·kg-1）

：模型＋给药 丹酚酸A组中剂量组（SalA, iv,5mg·kg-1）

：模型＋给药 丹酚酸A组高剂量组（SalA, iv,10mg·kg-1）：模型＋给药 丹酚酸B组（SalB, iv,10mg·kg-1）

每组12只大鼠，共计72只。按体重大小分层随机分配。实验时，按照计算机随机数字法确定的组别进行。

2.3给药方式和途径：

舌静脉注射，术后30min内完成。

2.4神经行为缺损积分的评定方法：

分别于大鼠苏醒和脑缺血24h后，根据文献[4

，5]

方法进行神经行为评分，标准如下：提

尾观察大鼠行为改变，出现对侧肩内旋、前肢内收者，视其轻重评为1～4分，否则为0分；在光滑水平面上横向推动大鼠肩部向对侧移动，根据向对侧推移阻力下降的程度评分，范围为0～3分；将大鼠两前肢置于金属网上，向后轻拉鼠尾，观察对侧前肢的抓力，根据对侧前肢肌力下降程度评分，范围为0～3分。

总分为10分，以单盲法评定，由两人完成。

2.5脑梗死指数（重量）的测定：

大鼠神经功能缺损评分后称取体重，断头处死，取脑，去除小脑、嗅球、脑干，称重。

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将鼠脑置于-20℃冰箱冻存30min取出，沿冠状方向均匀切成5片，将脑片放入1％的TTC溶液中，37℃避光温孵3min，染色后脑片用Tris液冲洗。非梗死区被TTC染为玫瑰红色，梗死区未着色，小心分离梗死区并称重，计算脑梗死指数（梗死区重量占脑重量的百分比）。

2.6脑水肿的测定：

2.6.1脑指数（重量）的测定

大鼠神经功能缺损评分后称取体重，断头处死，取脑，称重。计算脑指数（脑重量占体重的百分比）。 2.6.2脑含水量的测定

缺血24h后断头取脑，去除小脑、嗅球、脑干，称重并记录，置110℃烤箱内烤至恒重，记录，按下式计算脑含水量％：

脑含水量％＝（湿重－干重）/湿重×100％

2.7组织形态学观察：

每组各取脑冠状切片一张，片厚2mm，10％的甲醛固定，经脱水、石蜡包埋、切片后，HE染色，光镜下观察脑组织形态学变化。

2.8统计学方法

只有模型成功及给药成功者方被纳入统计（某些组实验动物数不足12只），数据以均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用t检验。

3. 结果

3.1丹酚酸A对永久性局灶性脑缺血大鼠神经行为评分的影响

从Tab 1可见，模型组与假手术组在苏醒后的神经行为评分有显著差异，说明模型成功；各给药组与模型组比较未见优势，说明此时药物尚未发挥效应。术后24h评分，模型组及给药组出现不同程度的下降，以丹酚酸A低剂量组最为明显，较第一次评分下降了5.67±3.20，与模型组比较有统计学意义(p＜0.05)。

表1 各组对永久性局灶性脑缺血大鼠神经行为评分的影响比较（x±s）

Tab 1 Effect of different group on score of neurological deficits after MCAO in rats（x±s） Group Dose/ mg•kg-1 n Difference of score Score

Come around

24h

Sham 12 0 0 0 Model 12 5.54±2.03＊ 3.08±2.39＊ 2.46±2.60＊ SalA 2.5 11 7.67±1.97△ 2±2.19 5.67±3.20△ 5 9 6.50±2.28 3.33±2.31 3.17±2.33 10 9 6.00±2.09 3.33±1.56 2.67±1.97 SalB 10 12 6.55±2.02 2.91±1.87 3.±2.16

＊

p＜0.001 vs Sham；△p＜0.05 vs Model

3.2 丹酚酸A对永久性局灶性脑缺血大鼠梗死指数的影响

由Tab 2可见，模型组与假手术组在此指标上差异明显，说明模型成功；各给药组脑梗

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死指数均低于模型组，说明药物有效；而各给药组中，丹酚酸A各剂量组与模型组比较均有统计学意义；其中丹酚酸低剂量组的效果相对较好(p＜0.01)。

表2 各组对永久性局灶性脑缺血大鼠梗死指数的影响比较

Tab 2 Effect of different group on infarct index after MCAO 24h in rats（x±s）

Group Dose/ mg•kg-1 n Infarct index（％）

Sham 12 0 Model 12 20.51±6.42＊ SalA 2.5 11 10.02±6.99△△ 5 9 13.98±6.68△ 10 9 12.26±8.92△ SalB 10 12 17.27±9.99

＊

p＜0.001 vs Sham ；△ p＜0.05，△△ p＜0.01 vs Model

3.3 丹酚酸A对永久性局灶性脑缺血大鼠脑水肿的影响

3.3.1各组脑指数的比较情况

从Tab 3可以看到，模型组与假手术组在脑指数上差异明显，说明模型成功；丹酚酸A各剂量组均好于模型组，丹酚酸B组效果不明显；其中丹酚酸A低剂量组效应较佳，与模型组比较有统计学意义（p＜0.05）。

表3 各组对永久性局灶性脑缺血大鼠脑指数影响比较

Tab 3 Effect of different group on cerebral index after MCAO 24h in rats （x±s） Group Dose/ mg•kg-1 n Cerebral Index（％）

Sham 12 0.44±0.03 Model 12 0.49±0.05＊ SalA 2.5 11 0.44±0.04△ 5 9 0.47±0.07 10 9 0.47±0.11 SalB 10 12 0.51±0.05

＊

p＜0.01 vs Sham；△ p＜0.05 vs Model

3.3.2各组脑含水量的比较情况

由Tab 4可见，模型组脑含水量与假手术组相比较差异明显，说明模型成功；各给药组与模型组相比较，均低于模型组；其中以丹酚酸A低剂量组作用较显著，与模型组比较有统计学意义（p＜0.001）。

表4 各组对永久性局灶性脑缺血大鼠脑含水量的影响比较

Tab 4 Effect of different group on cerebral water content after MCAO 24h in rats（x±s） Group Dose / mg•kg-1 n Water Content（％）

Sham 12 76.69±5.33 Model 12 87.46±2.93＊ SalA 2.5 11 83.18±1.39△△△ 5 9 83.81±2.67△△ 10 9 84.35±2.65△ SalB 10 12 85.58±2.38

＊ p＜0.001 vs Sham；

△ p＜0.05，△△ p＜0.01，△△△ p＜0.001 vs Model

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3.4丹酚酸A对永久性局灶性脑缺血大鼠脑组织形态学的影响

假手术组术侧半球可见神经细胞形态无异常，胞膜、核膜清晰，核仁明显；缺血模型组缺血区神经细胞呈不同程度的缺血性改变，胞体皱缩成三角形，胞浆嗜伊红深染，核固缩或溶解。缺血周边区有程度不等的渗出，细胞间隙增宽，血管扩张。丹酚酸A三个剂量组和丹酚酸B组缺血区神经细胞仅有轻、中度缺血性改变，细胞肿胀程度、间隙及胞核改变均较模型组为轻（见Fig 2）。

A B C F D E图2 丹酚酸A对造模后大鼠缺血区脑组织的影响（HE染色 200×）

Fig 2 Effect of SalA on HE staining in peri-ischemic region after MCAO 24h in rats（200×）

A：Sham operation；B：Model；C：SalA 2.5mg/kg；D：SalA 5mg/kg；

E：SalA 10mg/kg；F：SalB 10mg/kg

4. 讨论

脑缺血模型按照局部解剖学通常分为全脑缺血和局灶性脑缺血两大类，由于局灶性脑缺血与临床脑卒中的发病部位比较接近，因此应用较广。其中以大脑中动脉阻塞模型最为常见。

大脑中动脉是临床上脑缺血及脑梗死的易患部位，在脑梗死患者中，大脑中动脉主干分布区梗死占82.2%，其中70%有明显的栓子，所以大脑中动脉主干闭塞（MCAO）模型在脑血管病的研究中占有极其重要的地位[6]。采用线栓法制作局灶性脑缺血模型，成功模拟了临床缺血性脑血管病的病理过程，能较好地评价药物的抗脑缺血作用。上述研究即是在此模型上完成的。

测定脑缺血动物的脑梗塞指数、神经行为评分、脑含水量等指标，是观察药物对实验性脑缺血作用的直观指标[7作用。

研究表明，丹酚酸A能够明显改善急性脑缺血大鼠的神经行为缺损症状，显著减小梗塞指数，减轻脑水肿，且低剂量组（2.5mg/kg）效果较好，效应并不随剂量增加而线性增强，表现出神经保护剂的特点。该现象在许多药物研究中存在[9],机制尚不清楚,可能因药物同时有药理作用和毒性作用,浓度增高表现出毒性[10]。这说明神经保护剂治疗脑缺血时应当注重剂量,剂量过大可能会影响治疗效果。

以主要药效为导向，采用药效系统比较的方式，与现有同类中成药进行比较，了解拟开

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，8]

，因此本实验对其进行检测，以从整体水平评价丹酚酸A的保护

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发的新药是否具有疗效优势，然后再确定是否具有开发价值。这样才可能发现高效中药新药。与丹酚酸B治疗脑缺血相比较，在几个主要药效评价指标上，丹酚酸A的效应体现出更强的趋势。

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Protective effects of salvianolic acid A on focal cerebral

ischemia in rats

Shang Hongcai, Cao Hongbo, WangYang, Zhang Boli

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin (300193)

Abstract

Objective To explore the neuroprotective effects of salvianolic acid A on focal cerebral ischemia in rats. Methods Focal cerebral ischemia was induced by permanent occlusion of the proximal portion of left middle cerebral artery occlusion(MCAO). A neurological examination was performed on each rat come round, 24 hours after ischemia by the method of Berderson and Zhang. The infracted size was measured by 2,3,5-triphenrytetrazolium chloride(TTC) staining technique at 24 hours post-ischemia. Effect of salvianolic acid A on the histological neuronal changes were observed by means of HE staining. Results Salvianolic acid A significantly reduced infracted size, cerebral index, water content and score of neurological deficits. Protective effects of SalA on cerebral lesion were better than ones of SalB. Conclusion Salvianolic acid A was a good neuroprotective agent, but its dose-effect relationship was not evident.

Keywords: salvianolic acid A; focal cerebral ischemia; cerebral infarction index; cerebral water content; neurological score

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