食品添加剂对海洋拮抗酵母Rhod_省略_num抑制冬枣采后腐烂效果的影响_王一非

2009

JournalofZhejiangUniversity(Agric.&LifeSci.)文章编号:1008-9209(2009)02-0158-07

DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2009.02.007

食品添加剂对海洋拮抗酵母Rhodosporidiumpaludigenum抑制冬枣采后腐烂效果的影响

王一非,郑晓冬

(浙江大学生物系统工程和食品科学学院食品科学与营养系,浙江杭州310029)

摘　要:为了提高海洋拮抗酵母Rhodosporidiumpaludigenum的生防效果,研究该酵母与不同浓度碳酸氢钠(NaHCO3)和尼泊金酯钠盐配合使用对冬枣果实采后黑斑病(Alternariaalternata)的防治效果,以及碳酸氢钠和尼泊金酯钠盐对R.paludigenum酵母生长的影响.体内(invivo)、体外(invitro)试验结果表明,不同浓度的碳酸氢钠和尼泊金酯钠盐对R.paludigenum的生长均没有影响.同时,碳酸氢钠和尼泊金酯钠盐对酵母菌在冬枣果实伤口上的生长也没有抑制作用.但当R.paludigenum与0.3%NaHCO3、0.012‰(W/V)尼泊金乙酯钠或尼泊金丁酯钠溶液结合使用时可显著抑制冬枣果实黑斑病的发生;其中,R.paludigenum与0.3%NaHCO3合用对控制冬枣果实黑斑病的效果最好.说明R.paludigenum与某些食品添加剂结合使用在控制冬枣果实采后病害方面具有潜在的应用价值.关　键　词:海洋酵母拮抗菌;生物防治;采后病害;食品添加剂;冬枣中图分类号:Q939　　　文献标识码:A

WANGYi-fei,ZHENGXiao-dong(DepartmentofFoodScienceandNutrition,SchoolofBiosystemsEngineeringandFoodScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310029,China)

Controlofpostharvestdiseaseofjujubefruitbycombiningantagonisticyeastwithfoodadditives.JournalofZhejiangUniversity(Agric.&LifeSci.),2009,35(2):158-1

Abstract:BiocontrolefficacyofantagonisticyeastRhodosporidiumpaludigenumincombinationwithdifferentconcentrationsofsodiumbicarbonate(SBC)andsodiumparabenagainstpostharvestdiseasecausedbyAlternariaalternatainjujube(Zizyphusjujubacv.Dongzao)wasinvestigated.Meanwhile,theeffectofSBCandsodiumparabenonthecapabilityofgrowthofR.paludigenumwastested.TheresultsofinvivoandinvitrotestsindicatethatthecombinationofR.paludigenumwith0.3%NaHCO3,0.012‰(W/V)sodiumbutylparabenorsodiumethylparabencouldenhancetheinhibitionforjujubeblackrotcausedbyA.alternata.0.3%NaHCO3wasthemostconsistentinimprovingbiocontrolactivity.Inaddition,thegrowthofR.paludigenumwasnotinhibitedbySBCandsodiumparabeninthewoundsofjujubefruit.Therefore,R.paludigenumincombinationwithsomefoodadditivesmighthavegreatpotentialagainstpostharvestfungaldiseasesofjujubefruit.

Keywords:antagonisticmarineyeast;biocontrol;postharvestdiseases;foodadditives;jujube

　　收稿日期:2008-04-17

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30771514);国家高技术研究发展计划\"863\"资助项目(2006AA10Z348).作者简介:王一非(1981—),女,浙江嘉善人,博士研究生,主要从事食品微生物研究.E-mail:wangyifei@zju.edu.cn.通讯作者:郑晓冬,女,教授,博士生导师,主要从事食品微生物学研究.E-mail:xdzheng@zju.edu.cn.

　第2期王一非,郑晓冬:食品添加剂对海洋拮抗酵母Rhodosporidiumpaludigenum抑制冬枣采后腐烂效果的影响

159

　　果蔬产品采后损失在很大程度上由病原菌引起.化学杀菌剂具有作用机理明确、效价高且

效果稳定、并能控制采前潜伏感染的病原菌等优点,是常用的果蔬采后病害防治方法[1-2].但化学杀菌剂存在污染环境,不易分解,危害人类健康等缺点,以及公众对于食品安全的意识日益增强,其使用越来越多[4].因此,寻求安全、经济、有效地控制采后果蔬腐烂的新方法成为当务之急.生物防治是目前采后病害控制研究的热点之一.近年来,利用微生物进行生物防治取得了突破性进展,被认为是最有希望替代化学杀菌剂的方法之一

[5]

[3]

采摘时期选在商业成熟期.选择饱满圆润、外观整齐、无干枯、无机械损伤、无病害的果实.受试

果实运到实验室后立即进行处理,或是贮藏在室温(20～25℃)、相对湿度92%～94%的环境中,48h内使用.实验时将水果随机分组,供试果品不进行清洗和消毒.1.2　试剂及培养基

　　碳酸氢钠购自上海化学试剂公司,纯度为分析纯.尼泊金酯钠盐:对羟基苯甲酸丁酯钠(sodiumbutylparaben,SBP)和羟基苯甲酸乙酯钠(sodiumethylparaben,SEP)购自浙江圣效化学品有限公司,食品级.

　　NYDB培养基:营养肉汤8g L,酵母粉5g L-1,葡萄糖10g L-1(用于培养R.paludigenum的添加氯化钠20g L-1),121℃灭菌20min,待用.　　NYDA培养基:营养肉汤8g L-1,酵母粉5g L-1,葡萄糖10g L-1,琼脂20g L-1(用于培养R.paludigenum的添加氯化钠20g L),121℃灭菌20min,待用.　　PDA(马铃薯葡萄糖)培养基:200g去皮马铃薯加水煮30min后过滤,滤液中加入20g葡萄糖,20g琼脂,用蒸馏水定容至1000mL,121℃灭菌20min,待用.1.3　拮抗菌

　　试验用海洋拮抗酵母R.paludigenum分离自中国东海海域,经英国国际微生物所菌种保存和鉴定中心(CABIBioscienceIdentificationServices)鉴定为RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman(1984).将该酵母菌株活化后接入含有50mLNYDB的三角瓶中,28℃,200r min-1培养24h.得到的发酵液在3000r min-1下离心10min,收集菌体,用无菌水洗涤酵母菌体,并用其制成酵母菌悬液,血球计数板计数,用无菌水或不同浓度食品添加剂调整至浓度为1×108cells mL-1,待用.1.4　病原菌

　　试验用病原菌链格孢(A.alternata)购于中国科学院微生物研究所.菌种均用PDA斜面培养基28℃培养7～14d后于4℃保存待用.　　从病原菌保存斜面中挑取适量的霉菌孢子,在PDA斜面上划线,置于培养箱中.在28

[12]

-1

-1

.然而,有报道表明,只有当拮抗菌

[6]

在较高浓度时才能有效地防治各种病害.因

此,人们在寻找高效拮抗菌的同时,也在不断寻找能够提高拮抗菌活性的方法.

　　前人的研究表明,很多外源化学物质,如碳水化合物、金属盐类、植物激素、壳聚糖、氨基酸等与拮抗酵母结合使用,能够显著提高拮抗酵母的生物防治活性[7-11].冬枣是深受人们喜爱的果蔬类食品,由病原菌Alternariaalternata引起的黑斑病是冬枣果实采后在贮藏运输过程中经常发生的真菌性病害.随着冬枣产量的不断提高,如何通过合适的采后处理技术,延长果蔬的贮藏和销售期,降低采后损失,对减轻农民负担以及提高果蔬种植产业的效益非常重要.目前采用生物防治的方法尤其是采用海洋酵母控制冬枣采后病害国内外未见报道.笔者从中国东海海域筛选到了1株海洋酵母,经英国国际微生物研究所(CABIBioscienceIdentificationServices)鉴定为Rhodosporidiumpaludigenum.试验表明,R.paludigenum对樱桃番茄果实采后黑斑病(由A.alternata引起)和灰霉病(由Botrytiscinerea引起)具有较好的抑制效果[12].本研究拟通过体内(invivo)和体外试验(invitro)分析食品添加剂对R.paludigenum拮抗A.alternata的效果和对该酵母生长动态的影响,旨在为开展冬枣采后病害生物防治技术的研究提供理论基础.

1　材料和方法

1.1　水　果　　冬枣果实(Zizyphusjujubacv.Dongzao)

160

农业与生命科学版)浙江大学学报(

第35卷　

℃培养7d后,用接种环在培养好的霉菌试管斜面上刮取适量孢子,转移到适量0.05%吐

温-20(tween-20)溶液中,用血球计数板计数,并用0.05%吐温-20溶液调整至5×104spores mL

-1

调整至1×108cells mL-1,待用[15].

　　每个处理选取20个冬枣果实,置于塑料筐

中,用打孔器在果实赤道部位制造伤口(5mm×5mm).3个处理分别为:(A)0.3%NaHCO3;(B)1×108cells mL-1R.paludigenum细胞悬浮液;(C)0.3%NaHCO3+1×10cells mLR.paludigenum细胞悬浮液;对照为无菌水.在每个果实伤口接种30μL上述处理液,4h后,接入15μL浓度为5×104spores mL-1链格孢孢子悬浮液.果实晾干后,用保鲜膜封口以保持湿度(95%左右),处理果实贮于室温(20～25℃)下,5～7d后观察并记录果实的腐烂率.每个处理3个平行,试验重复2次.1.6.2　食品防腐剂对海洋酵母R.paludigenum抑制冬枣采后链格孢效果的影响　　将酵母菌株R.paludigenum按1.3节方法活化、培养、离心和计数后用无菌水或0.012‰尼泊金乙酯钠溶液(SEP)或尼泊金丁酯钠溶液(SBP)调整至1×108cells mL-1,待用.　　每个处理选取20个冬枣果实,置于塑料筐中,用打孔器在果实赤道部位制造伤口(5mm×5mm).尼泊金酯钠盐结合海洋酵母的3个处理分别为:(A)0.012‰SEP或SBP;(B)1×108cells mL-1R.paludigenum;(C)0.012‰SEP或SBP+1×10cells mLR.paludigenum;对照均为无菌水.在每个果实伤口接种30μL上述处理液,4h后,接入15μL浓度为5×104spores mL链格孢孢子悬浮液.果实晾干后,用保鲜膜封口以保持湿度(95%左右),处理果实贮于室温(20～25℃)下,5～7d后观察并记录果实的腐烂率.每个处理含有3个平行,试验重复2次.1.7　食品添加剂对海洋酵母R.paludigenum在果实伤口生长动态的影响

　　采用血球计数法研究碳酸氢钠和尼泊金酯钠盐对R.paludigenum在冬枣伤口处生长动态的影响.

　　每个处理选取20个果实,用打孔器在果实赤道部位制造伤口(5mm×5mm).各处理如下:1×108cells mL-1R.paludigenum;0.012‰SEP或SBP;0.3%NaHCO3+1×108

-1

8

-1

[15]

8

-1

,待用

[13-14]

.

1.5　食品添加剂对海洋酵母R.paludigenum

体外(invitro)抑制试验1.5.1　食品添加剂对海洋酵母R.paludigenum在固体培养基上生长的影响　　采用平板杯碟抑菌试验研究外源物质对R.paludigenum在固体培养基上生长的影响.受试外源物质为:0.006‰、0.012‰、0.06‰、0.12‰(W/V)尼泊金乙酯钠和尼泊金丁酯钠溶液;0.1%、0.3%、1%(W/V)NaHCO3.用无菌移液管吸取1mL1×108cells mL-1R.paludigenum,均匀涂布NYDA平皿(15mL 板),在平板放置不锈钢圆筒(直径为5mm),接入200μL上述各溶液,在28℃培养2～4d,观察酵母生长情况,记录抑菌圈大小.1.5.2　食品添加剂对海洋酵母R.paludigenum在液体培养基中生长的影响　　采用摇瓶培养试验研究外源物质对R.paludigenum在液体培养基上生长的影响.受试食品添加剂为:0.006‰和0.012‰(W/V)尼泊金乙酯钠和尼泊金丁酯钠溶液.将灭菌处理后的各外源物质加入到20mLNYDB液体培养基的250mL三角瓶中,使其达到最终所需浓度.然后加入海洋酵母R.paludigenum细胞悬浮液,使酵母菌起始浓度为105cells mL-1.28℃下以200r min-1的转速振荡培养,0、12、24、48、72h分别取样,测定R.paludigenum的数目.　　酵母数测定方法:将样品稀释至适当浓度,在显微镜下用血球计数器对酵母数量进行统计,每个处理重复3次,试验重复2次,结果以每mL总酵母数量为单位/(logcells mL-1).1.6　食品添加剂对海洋酵母R.paludigenum体内(invivo)抑制试验

1.6.1　碳酸氢钠对海洋酵母R.paludigenum抑制冬枣采后链格孢效果的影响　　将酵母菌株R.paludigenum按1.3节方法活化、培养、离心和计数后用无菌水或0.3%碳酸氢钠溶液

[8-10]

-1

　第2期王一非,郑晓冬:食品添加剂对海洋拮抗酵母Rhodosporidiumpaludigenum抑制冬枣采后腐烂效果的影响

161

cells mL-1R.paludigenum.在果实伤口接种30μL上述各处理液.果实晾干后放置于塑料

篮中,用保鲜膜封口以保持湿度并于25℃下贮藏.每隔0、12、24、48、72h取样测定果实伤口处的R.paludigenum酵母数.

　　水果伤口处酵母数的测定方法为:在酒精灯火焰下用无菌的直径为1cm的打孔器将果实伤口处组织取出,放置于定量无菌蒸馏水中,用研钵捣碎,稀释至适当的浓度,在光学显微镜下用血球计数法计数,每个处理重复3次,试验重复2次,结果以每mL总酵母数量为单位/(logcells wound).

1.8　数据处理与分析　　采用SAS软件(SASInstitute,version6.08,Cary,NC)进行数据统计,采用ANOVA对数据进行邓肯多重差异分析(P<0.05).

-1

2　结果与分析

2.1　不同食品添加剂对海洋酵母R.paludigenum体外(invitro)抑制试验2.1.1　食品添加剂对海洋酵母R.paludigenum在固体培养基上生长的影响　　通过杯碟法研究不同浓度尼泊金酯钠盐(0.006‰、0.012‰、0.06‰、0.12‰)和碳酸氢钠溶液(0.1%、0.3%、1%)对R.paludigenum在NYDA固体培养基上生长的影响.试验结果显示,在28℃培养2～4d后,不同浓度的尼泊金乙酯钠、尼泊金丁酯钠溶液或碳酸氢钠溶液对R.paludigenum在NYDA培养基的生长均没有显著影响.2.1.2　食品添加剂对海洋酵母R.paludigenum在液体培养基中生长的影响　　将不同浓度的食品添加剂加入NYDB培养基中,观察其对R.paludigenum生长的影响,试验结果见图1.从图1中可以看出,0.006‰和0.012‰(W/V)尼泊金乙酯钠或尼泊金丁酯钠溶液对R.paludigenum生长均没有显著影响.2.2　不同食品添加剂对海洋酵母R.paludigenum拮抗活性的影响

2.2.1　碳酸氢钠对海洋酵母R.paludigenum抑制冬枣采后链格孢效果的影响　　将碳酸氢

钠与R.paludigenum结合起来处理冬枣,考察碳酸氢钠对R.paludigenum抑制冬枣采后链格孢效果的影响,其结果见图2.从图2可

知,0.3%NaHCO3单独使用时冬枣腐烂率有所下降,但是其发病率高于碳酸氢钠和R.paludigenum结合使用.R.paludigenum单独使用或结合碳酸氢钠使用能更加显著地降低冬枣采后由链格孢菌引起的腐烂.NaHCO3对R.paludigenum的生防效果有一定的促进作用,当0.3%NaHCO3和1×10cells mLR.paludigenum细胞悬浮液结合使用时,冬枣黑斑病发病率仅为37.5%,显著低于对照(发病率为90%),比R.paludigenum单独使用时发病率降低了9%.2.2.2　尼泊金酯钠盐对海洋酵母R.paludigenum抑制冬枣采后链格孢效果的影响　　将食品防腐剂尼泊金酯钠盐(浓度为0.012‰的尼泊金乙酯钠和尼泊金丁酯钠)与R.paludigenum结合起来处理冬枣,考察尼泊

8

-1

图1　尼泊金酯钠盐对R.paludigenum在

NYDB中生长的影响

Fig.1　EffectsofsodiumparabenonpopulationofR.

paludigenuminNYDB

162

农业与生命科学版)浙江大学学报(

第35卷　

　　A:0.3%NaHCO3;B:1×108cells mL-1R.paludigenum;C:0.3%NaHCO3+1×108cells mL-1R.paludigenum;CK为无菌水.图中所列数据为2个重复的平均值,箭头表示2个重复的标准差.柱状图上的不同小写字母表示通过邓肯多重范围分析差异显著(P≤0.05).

图2　碳酸氢钠对海洋酵母R.paludigenum抑制冬

枣采后病原菌链格孢效果的影响

Fig.2　EffectofR.paludigenumandsodiumbicarbonate

oninhibitionofA.alternataonthejujube

金酯钠盐对R.paludigenum抑制冬枣采后链格孢的影响,其实验结果见图3.从图3可知,与对照相比,浓度为0.012‰的尼泊金酯钠盐

单独使用时对冬枣采后黑斑病没有抑制作用,R.paludigenum单独使用或结合尼泊金酯钠盐能显著降低冬枣黑斑病的发病率.尼泊金酯钠盐对R.paludigenum有一定的增效作用,当1×10cells mL

8

-1

　　A:0.012‰SEP或SBP;B:1×108cells mL-1R.paludigenum;C:0.012‰SEP或SBP+1×108cells mL-1R.paludigenum;CK为无菌水.图中所列数据为2个重复的平均值,箭头表示2个重复的标准差.柱状图上的不同小写字母表示通过邓肯多重范围分析差异显著(P≤0.05).

图3　尼泊金酯钠盐对海洋酵母R.paludigenum抑制

冬枣采后病原菌链格孢效果的影响

Fig.3　EffectofR.paludigenumandsodiumparabenon

inhibitionofA.alternataonthejujube

R.paludigenum细胞悬

浮液分别和浓度为0.012‰的尼泊金乙酯钠或尼泊金丁酯钠结合使用时,冬枣黑斑病发病率比R.paludigenum单独使用时有所降低,但是其对R.paludigenum的增效作用小于0.3%NaHCO3.

2.3　食品添加剂对海洋酵母R.paludigenum在冬枣果实伤口生长动态的影响

　　将R.paludigenum与0.3%碳酸氢钠溶液、0.012‰尼泊金乙酯钠溶液或尼泊金丁酯钠溶液混合后接种于冬枣果实伤口,观察其在冬枣伤口的生长动态,结果见图4和图5.R.paludigenum被接种到冬枣伤口后迅速繁殖,24～48h后冬枣果实伤口处的酵母数量是接种时的50～100倍.0.3%碳酸氢钠溶液、0.012‰尼泊金乙酯钠溶液或尼泊金丁酯钠溶液对R.paludigenum在冬枣果实伤口处的生

试验重复2次,箭头表示标准偏差.

图4　碳酸氢钠对海洋酵母R.paludigenum在冬枣

果实伤口处生长动态的影响

Fig.4　PopulationdynamicsofR.paludigenumaloneorin

combinationwithsodiumbicarbonateinwoundsofjujubefruitincubatedat25℃

　第2期王一非,郑晓冬:食品添加剂对海洋拮抗酵母Rhodosporidiumpaludigenum抑制冬枣采后腐烂效果的影响

163

长没有抑制作用.枣果实采后由A.alternata引起的黑斑病有一定地抑制效果,并能与R.paludigenum结合

使用产生对病害防治的叠加效果,且该浓度的碳酸氢钠对R.paludigenum的生长没有抑制作用.其原因可能是0.3%碳酸氢钠的添加改变了果实伤口处的pH值,从而减弱了A.alternata在果实处的侵染.但pH值对冬枣果实抗病性和A.alternata的确切机理还有待于进一步研究.

　　尼泊金酯钠盐被认为是安全的食品防腐剂

[24]

试验重复2次,箭头表示标准偏差.

.我国果蔬行业尼泊金酯钠盐允许使用

-1

图5　尼泊金酯钠盐对海洋酵母R.paludigenum在

冬枣果实伤口处生长动态的影响

Fig.5　PopulationdynamicsofR.paludigenumaloneor

incombinationwithsodiumparabeninwoundsofjujubefruitincubatedat25℃

限量为12mg kg.本文研究结果显示,0.012‰尼泊金乙酯钠和尼泊金丁酯钠单独作用对R.paludigenum的生长没有影响同时也不能抑制冬枣黑斑病的发生.但是0.012‰尼泊金乙酯钠或尼泊金丁酯钠与R.paludigenum结合使用后,能提高R.paludigenum对冬枣采后A.alternata的抑制效果,其机理还有待深入研究.生防制剂要取代化学杀菌剂,必须考虑施用成本及安全性[5].尼泊金酯钠盐有较为清楚的毒理学背景,且尼泊金酯的添加量只有山梨酸、苯甲酸的1/10～1/[24]5,因而具有价格上的优势,尼泊金酯钠盐与R.paludigenum结合使用极具推广潜力.　　总之,新型生防拮抗海洋酵母R.paludigenum可与多种食品添加剂结合使用以进一步提高其生物防治效果,因此是一株很有前途的采后生防拮抗菌.

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andvegetablesafterharvestbytheuseofbiocontrol

23:

3　讨　论

　　R.paludigenum作为来自于海洋的微生物,具有耐受低温和高渗透压胁迫等优良特性,一旦应用于果蔬采后病害生物防治则具有其他微生物所不能比拟的优点,关键是怎么提高它对果蔬病害的生物防治能力.

　　本试验结果表明,R.paludigenum和碳酸氢钠或尼泊金酯钠盐相结合可以提高其对冬枣采后病害的防治效果,且碳酸氢钠的效果优于尼泊金酯钠盐.

　　碳酸氢钠是国际公认的安全物质(GRAS),被广泛用于果实保鲜领域

[16]

.前人已报道碳酸

氢钠能提高多种拮抗菌种的生防效果.Smilanick等[17-19]发现拮抗细菌PseudomonassyringaeESC-10结合3%碳酸氢钠能更有效地控制柑橘绿霉病.而拮抗酵母Candidasaitoana结合碳酸氢钠进行采前处理能提高对苹果和柑橘的病害抑制率

[20]

.Tian等

[21-24]

报

道碳酸氢钠能提高C.laurentii和Trichosporonpullulans对梨、枣和番茄等果蔬采后扩展青霉(Penicilliumexpansum)、A.alternata和Botrytiscinerea等的抑制效果.从本研究结果可知,0.3%碳酸氢钠单独使用对冬

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