肿瘤标志物

肿瘤是一类严重威胁人类生命健康的疾病，是工业化国家人口继心血管疾病之后位居第二的常见死因。近年来，我国癌症的发病率亦呈上升趋势，恶性肿瘤居城市人口死因的首位。世界卫生组织指出，癌症患者如果能早期发现,治愈率可达80%。早期发现，早期诊断，早期治疗是我国肿瘤诊治的国策。所以，长期以来人们致力于寻找一种能够尽早检出恶性肿瘤的方法，并且发现在当前所有医学手段中肿瘤标志物常常是唯一能早期发现肿瘤的线索。学术界对肿瘤标志物寄予厚望，从而促进了肿瘤标志学的诞生和发展。

第一节 肿瘤与肿瘤标志物的概念

肿瘤（tumor）是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。一般认为，肿瘤细胞是单克隆性的，即一个肿瘤中的所有瘤细胞均是一个突变的细胞的后代。 一般将肿瘤分为良性和恶性两大类，所有的恶性肿瘤总称为癌症（cancer）。肿瘤标志物（tumor maker）是1978年召开的人类免疫及肿瘤免疫诊断会上提出的，次年在第七届肿瘤发生生物学和医学会议上作为专业术语被公认，目前肿瘤标志物研究已逐渐成为一门的学科。

一、肿瘤标志物的概念

肿瘤标志物(tumor markers) 是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞合成、释放或者是宿主与肿瘤相互作用而产生并进入到体液或组织中可反映肿瘤存在和生长的一类生化物质，主要有酶、激素、胚胎抗原、糖蛋白类抗原、特殊蛋白类抗原以及某些癌基因蛋白等。用化学、免疫学和分子生物学方法对血液、体液及组织中肿瘤标志物进行定量或定性检测，可以作为肿瘤筛查(仅AFP 与PSA 用于高危人群)、鉴别诊断、治疗后病情监测及预后判断的标志与依据。

理想的肿瘤标志应具备以下条件：①肿瘤标志物含量与肿瘤的消长或转移有直接或定量的比例关系；②标志物具有较高特异性，能明显区别于正常人和良性肿瘤，假阳性或假阴性率低；③肿瘤本身应含有该肿瘤标志物，若为肿瘤所特有则更理想；④检测该标志物的方法简便、易推广，而且成本低。然而目前绝大多数肿瘤标志物都未完全符合上述条件，且或多或少存在于正常成人和胎儿中。所以，进一步寻找新的、更有价值的肿瘤标志物应予以重视。

二、肿瘤发生的生化机制

肿瘤是失去了正常生物的异常生长、分化的细胞和组织，其特异的生长方式及代谢改变导致了某些酶的异常，特别是同工酶的改变,使得这些酶可作为筛查肿瘤的标志物。肿瘤发生时，患瘤组织分泌异位激素、内分泌组织反应性增加或减少激素分泌，最终导致患者激素水平异常，因此激素也是一种肿瘤标志物。胚胎抗原是胎儿时期才有的蛋白，成人后逐渐下降或消失，某些癌症患者的胚胎抗原重新出现可能与恶性细胞转化时激活了某些成年后已关闭的基因相关，所以胚胎抗原至今仍是临床常用的重要肿瘤标志物。大多数实体瘤由上

皮细胞衍生而来，当肿瘤细胞快速分化、增殖时，一些在正常组织中不表现的细胞类型或组分大量出现成为肿瘤标志，该类标志的分子组成往往是不含糖或脂的蛋白质类，能体现多种肿瘤共有的增殖特性，因而器官特异性差，是广谱肿瘤标志。糖蛋白类抗原是新一代的肿瘤标志，远较酶和激素类标志敏感和特异，当正常细胞转化为恶性细胞时，细胞表面的糖蛋白发生变异形成一种与正常细胞不同的特殊抗原，可用单克隆技术检测，该类标志的诞生促进了肿瘤标志学的发展和临床应用。随着肿瘤分子生物学的发展，癌基因的发现使人们开始考虑利用血清中出现的癌基因表达蛋白作为肿瘤标志物，因为在一些癌基因（至少3种～4种）共同作用下，正常细胞转化为恶性细胞，异常生长、分化，导致肿瘤的发生。 三、肿瘤标志物的分类

肿瘤标志物可其特异性和自身化学特性进行分类。按特异性可分为2类：①肿瘤特异性标志物，即某种肿瘤所产生的特异性物质。如前列腺特异性抗原（PSA）就是前列腺肿瘤所产生的特异性标志物质，只有所患肿瘤为前列腺癌时，PSA才会显著升高；②肿瘤辅助标志物，由一类组织类型相似而性质不同的肿瘤产生，也可存在于正常人群和非肿瘤患者中，其在肿瘤患者中的浓度高于非肿瘤患者。按其本身化学特性可分为以下7类（见表49-1-1）：①酶和同工酶；②激素；③胚胎抗原；④蛋白类；⑤糖蛋白类；⑥基因标志；⑦其他肿瘤标志。本章主要对临床上较常使用、临床价值比较肯定的若干种肿瘤标志物加以介绍。

第二节 肿瘤标志物的测定方法

肿瘤标志物的主要检测方法是生物化学比色法（酶类）和免疫检测法，随着科学技术的进步，即使酶类也越来越多使用免疫检测法。现代免疫学测定主要包括放射免疫测定（RIA）、酶联免疫测定（EIA）和荧光免疫测定（FIA）等三大技术，具有特异、敏感、快速、操作简单、稳定性好，能定量等优点，广泛用于科研和临床各实验室。其中RIA由于使用放射性物质对人体健康有一定损害，已逐渐被EIA和FIA所取代；FIA因灵敏度高、易于自动化正逐渐成为主流。此外，高效液相色谱法及分子生物学方法也可用于测定特定的肿瘤标志物及进行相关研究。

一、免疫化学测定法

利用抗原抗体反应和分离技术检测肿瘤标志物的方法称为免疫化学测定法，包括放射免疫法和化学发光法（CLIA）两类，后者又可分为酶联化学发光法（EMCLIA）、偏振荧光法（FPIA）、时间分辨荧光法（TRFIA）、电化学发光法（ECLIA）等。放射免疫分析是体外竟争性放射结合分析方法中应用最为广泛的一种免疫分析方法，由于它将待测物浓度以放射示踪剂的放射性计数来表达，因而可对生物体内那些浓度仅为10～10g/ml，甚至更低浓度的物质进行较准确的定量，是一种超微量的分析技术。化学发光法则是以化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫测定方法，它利用化学反应释放出的大量自由能使发光剂产生激发态中间体，当该激发态中间体回到稳定基态时会发射出光子，再由发光信号测量仪器分析所发出光量子产额，从而完成对肿瘤标志物浓度的测定。

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目前，CLIA法已得到临床实验室的广泛应用，它不仅具有RIA的灵敏度高及特异性强的优点，而且试剂安全无毒，无放射性污染，因此完全可以替代RIA法。常用的标记发光剂有HRP、微过氧化物酶、鲁米诺、洛粉碱、光泽精、吖啶酯及联吡啶钌Ru(bpy)3等。影响化学发光测量的因素包括：①样品浑浊度增高，将使测定灵敏度下降，因为大多数发光仪只能测出样品发射的总光量，无法扣除浑浊导致的散射光；②样品中含有强的吸收或发射荧光的物质，特别是生物样品中的一些发光催化剂和淬灭迹将严重影响测定的准确度；③pH 值的影响也是一个重要因素，化学发光试剂如鲁米诺往往要求碱性环搅，即pH>9，但催化剂〈酶〉及样品，特别是生物样品则要求中性的反应环境，一般不得高于8.5，这就要求两者兼顾，选择一个该项发光反应的最适pH值条件；④温度要求在25℃～28℃之间；⑤高浓度的盐主(包括缓冲溶液)可能抑制酶的活性，从而使发光强度减弱。此外，试剂注入量的准确性、加入速度的快慢，测试管的大小及清洁程度以及杂散光等均可严重影响化学发光的测量。 二、高效液相色谱法

高效液相色谱法亦称高压液相色谱法，是在经典液相色谱基础上，引用气相色谱理论，流动相采用高压输送(最高可达80MPa)，固定相采用高效微粒填料以特殊方法填充，从而使柱效大大高于经典液相色谱的测定方法，具有分析测定速度快、分离效率高、灵敏度高、数据采集与处理自动化等特点。该法应用范围极广，只要求样品能制成溶液，对于高沸点、不挥发性、热不稳定以及高分子量的化合物均能分析。如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、皂甙、类脂、维生素、抗生素、激素以及其它无机盐类，都可用高效液相色谱法进行分离分析。由于该法测定肿瘤标志物的灵敏度高、样品用量小、干扰因素少、回收率高且重复性好，因而深受研究人员青睐。

高效液相色谱法按固定相性质可分为液-液色谱(LLC)和液一固色谱(LSC) 两大类；按分离原理可分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱及凝胶色谱四种类型。不同类型高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本与相对应的普通液相层析原理相似，不同之处在于高效液相色谱更加灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。色谱柱中的固定相是分离测定时最关键的部分，直接关系到柱效，不同类型的高效液相色谱法对固定相的要求有所不同。而当固定相确定后，必须正确选择流动相的种类，配比才能获得好的分离效果。选择流动相时应注意下列几个因素：①与固定相不互溶，否则会造成固定相流失，使柱的保留特性改变；②不与固定相发生化学反应；③对样品要有适宜的溶解度，否则在柱头易产生部分沉淀，损害色谱柱；④应与检测器匹配，例如，用紫外检测器时，不能选用对紫外光有吸收的溶剂；⑤溶剂的粘度要小，以降低色谱柱的阻力，例如乙醇的粘度比甲醇大，选用甲醇作流动相较好。此外，在选择流动相时，流动相的极性(洗脱能力)也是必须考虑的一个因素。例如在液固色谱法中.所用的吸附剂(硅胶、氧化铝、聚酰胺〉都是极性较强的固定相，因此应选用极性较强的流动相来洗脱。在实际分析中，为了获得更合适的溶剂作流动相，常采用二元或多元组合的溶剂系统。

三、免疫组化法

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免疫组化法（immunohistochemistry，IHC）即免疫组织化学测定法，是利用酶、荧光素、金属离子、同位素等标记的特异性抗体（或抗原）对组织细胞内抗原（或抗体）分布进行组织原位的定性、定位或定量检测，通过检测肿瘤相关抗原（肿瘤分化抗原和肿瘤胚胎抗原）的存在与否，判断肿瘤的来源及分化程度，辅助肿瘤病理诊断与鉴别诊断，具有高度的特异性和敏感性，是近10多年来迅速发展起来的一门新兴技术。

免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。常用的免疫组化染色法有过氧化物酶-抗过氧化物酶法（peroxidase - antiperoxidase technique，PAP法）和卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法（avidin–biotin - peroxidase complex technique，ABC法)。免疫组化染色具体包括酶的消化、内源性酶的处理，非特异性染色的消除，抗体的稀释、滴加抗体的方法、切片的洗涤，孵育方法等技术。染色过程中应注意以下问题：①采用蛋白酶消化以消除非特异性免疫染色，暴露甲醛固定过程中被封闭的抗原决定簇，但应注意有的抗原决定簇不能被封闭，不需要进行消化，否则反而会破坏抗原性，降低阳性率。一般来说，消化时间与组织固定时间呈正相关。消化浓度和时间应根据标本和所使用蛋白酶的活性以及实验室条件来决定，防止过度消化并使用粘附剂以防脱片；②非特异染色干扰特异性染色时易引起错误判断，其原因多来源于靶组织或标记物，最常见原因是蛋白粘附于高电荷的胶原和结缔组织成分，因此清除非特异性染色，对提高免疫染色效果和正确评价免疫染色结果有重要意义。③抗原与抗体的最适浓度是完成反应的关键，抗体浓度过高会导致其结合减少，产生假阴性结果，因此，必须使用一系列稀释度作“棋盘式效价滴度”来确定抗体的最佳稀释度，以获得最大强度的特异性染色和最弱的背景染色。影响抗体稀释度的因素包括抗体效价、抗体溶液中非特异性蛋白量、温育时间、稀释缓冲液的种类以及标本的固定和处理等，每个实验室应该根据自己的条件决定最适宜的稀释度。 四、酶学测定法

肿瘤的发生、发展涉及全身多种酶类，酶类肿瘤标志物高敏感性、低特异性的特点使其主要用于肿瘤治疗和预后的监测。目前，临床上主要测定酶的活性，由于易受干扰、稳定性差，不少学者建议测定酶质量代替测定酶活性。

常用的酶学测定法利用酶有加速化学反应的特性，通过测定被加速化学反应的反应速率，根据酶促反应中底物的减少量或产物的生成量来计算酶活性浓度的高低。按监测方法分类可分为量气法、分光光度法、荧光法、放射性核素法、电极法及其他方法，以分光光度法最为常用。按反应时间分类，酶活性浓度测定方法又可分为定时法和连续监测法，随着各种自动生化分析仪的广泛应用，后者已逐步取代前者成为临床实验室测定酶活性浓度最常用的方法。临床测定酶活性浓度时的干扰因素包括被测酶以外的其他酶类和物质、非酶反应、反应体系的污染及形成沉淀等，解决方法一是通过试剂空白加以校正，二是改用双试剂测定。测定酶活性方法所应选择的最适条件主要与下述因素有关：①底物、辅因子、激活剂、缓冲液和变构剂种类及浓度；②指示酶与辅助酶的种类和浓度；③反应混合液PH和离子强度；

④其他可变因素，如已知抑制剂的去除等。

测定酶活性浓度受诸多因素影响，为提高准确性和精密度，使酶测定结果在方法间、实验室间有可比性，开展酶学测定的标准化工作势在必行。标准化的途径包括使用推荐方法和参考方法，使用公认的酶校正物或酶参考物。

参考文献

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表49-1-1 肿瘤标志物的分类