生物学教学２０１８年（第４３卷）第ｌｌ期 ·５９· 核移植胚胎干细胞的制备、特性和应用概述 征月良 （１临沂大学生命科学学院临沂２７６０００） 摘要从克隆胚胎中分离、培育而成的干细胞称为核移植胚胎干细胞。核移植胚胎干细胞有正常的核型，表现碱性磷酸酶活性， 能分化成其他类型的细胞，对于疾病治疗研究具有重要的价值。本文概述核移植胚胎千细胞的制备、特性和应用，并讨论了人核移 植胚胎干细胞的制备的伦理问题。 关键词 核移植胚胎干细胞克隆囊胚胚胎嵌合细胞治疗 近年来，核移植技术发展迅速，已经利用此技术获 得了多种克隆动物。核移植后，从克隆胚胎中分离、培 育而成的干细胞称为核移植胚胎干细胞（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＮＴＥＳＣ），这种细胞对于胚 化：在人卵母细胞去核过程中，卵母细胞需用咖啡因 处理，以防止过早活化；用作核供体细胞的人成纤维细 胞需先用灭活血凝病毒处理，然后放到去核卵母细胞 的卵周隙中，使其与卵母细胞融合，获得成纤维细胞和 去核卵母细胞的重构体；对重构体需先用电脉冲进行 激活，然后培养于含有二甲基氨基嘌呤的培养液中，获 得克隆胚胎，克隆胚胎发育成囊胚，便可以用来制备人 的ＮＴＥＳＣ 。 胎嵌合研究和细胞治疗研究均具有重要的意义。本文 概述ＮＴＥＳＣ的制备、特性和应用。 １ ＮＴＥＳＣ的制备 小鼠的ＮＴＥＳＣ来自克隆胚胎。将小鼠成纤维细 胞核或卵丘细胞核移入去核卵母细胞，并在核移植胚 胎发育至囊胚时除去囊胚的透明带，放在含有饲养层 细胞的培养皿中培养就可获得ＮＴＥＳＣ，接着便可以使 用小鼠成纤维细胞或卵丘细胞进行核移植，均能 得到有正常核型、呈现碱性磷酸酶活性的小鼠 ＮＴＥＳＣ…。ＮＴＥＳＣ既可由同种核移植胚胎获得，也可 用胰酶消化法对ＮＴＥＳＣ进行传代。核移植后，从克隆 胚胎中制备第１个ＮＴＥＳＣ系。用第１个ＮＴＥＳＣ系作 为核供体细胞，进行第２次核移植，获得第２个ＮＴＥＳＣ 系。以此方法可制备多个ＮＴＥＳＣ系…。核移植后，克 隆胚胎可以发育至囊胚，但是大部分胚胎不能建立正 常的胎盘组织，导致胎儿发育异常或停止，这可能是由 某些基因组重编程错误所引起。重编程错误会影响囊 胚滋养层的功能，滋养层功能下降不利于正常胎盘的 形成，影响克隆胚胎的植入和发育。但是，研究发现只 要克隆囊胚中存在功能正常的内细胞团细胞，就可以 用这部分细胞制备ＮＴＥＳＣ 。在克隆胚胎中，常出现 些表观遗传错误，导致胎盘发育失败，而ＮＴＥＳＣ的 获得不需要胎盘，甚至可从注定要死亡的胚胎中制备 一用异种核移植胚胎制备。将人成纤维细胞与去核兔卵 母细胞融合后培育成异种克隆胚胎，进一步培育就可 以获得人一兔异种ＮＴＥＳＣ。 ２ ＮＴＥＳＣ的特性 ２．１ 表达阶段特异性胚胎抗原和肿瘤排斥抗原 ＮＴＥＳＣ在体外培养时，能形成类胚体。在类胚体的外 部细胞中会出现三类特异性蛋白的表达：①巢蛋白和 烯醇酶等外胚层细胞标志；②肌血红素、平滑肌肌动蛋 白以及血管内皮生长因子受体等中胚层细胞标志； ③甲胎蛋白和抗胰蛋白酶等内胚层细胞标志 Ｊ。 ２．２具有分化能力将小鼠ＮＴＥＳＣ注射到小鼠的腹 膜中，形成的畸胎瘤含有三个胚层，可分别分化成神经 元、肠上皮、软骨及脂肪组织 。用来制备ＮＴＥＳＣ的 ＮＴＥＳＣ，这是ＮＴＥＳＣ相对于胚胎干细胞的一大 优势 。 小鼠克隆胚胎通常具有发育成后代的潜能，但小鼠孤 雌胚胎不能发育成后代。这种孤雌胚胎可用来获得孤 雌胚胎干细胞，并将其作为核供体进行核移植，制备孤 雌ＮＴＥＳＣ，所得孤雌ＮＴＥＳＣ也可分化成神经元和中胚 改革重大研究项目“生物学习室·学具开发及其教学 研究”，Ｎｏ．２０１５ｊｓｓｊｙｓ一１５） 小鼠ＮＴＥＳＣ的制备方法基本上适用于人ＮＴＥＳＣ 的培育，但需对卵母细胞去核、融合、激活方案进行优 行充分评估，邀请其他教师及部分学生审阅。此外，教 师还可运用作品展示、竞赛评比和小组加分等多元化 的评价方式，及时反馈学生学习情况，让学生享受成功 带来的喜悦 。 （基金项目：江苏省教育科学２０１４年规划课题 “初中生物学模型制作与模拟实验的研究”，Ｎｏ．Ｂ．ｂ／ ２０１３／０２／３１１；江苏省中小学教研室２０１５年课程教学 主要参考文献 ［１］佐藤正夫．教学原理［Ｍ］．北京：教育科学出版社，２０１４：１５１． ［２］史桂梅．初中生物学课堂教学中学生活动的设计策略［Ｊ］．生 物学教学，２０１７，４２（１）：２８． ·６０· 生物学教学２０１８年（第４３卷）第１１期 得克隆胚胎，并从克隆胚胎中制备患者自身的ＮＴＥＳＣ。 这种自身ＮＴＥＳＣ分化产生的功能细胞在核基因型上等 层细胞。例如，将孤雌ＮＴＥＳＣ注入小鼠受精囊胚，可产生 嵌合体小鼠，在嵌合体小鼠的大脑、肝脏、肾脏、心脏、肠及 皮肤中，由孤雌ＮＴＥＳＣ分化来的细胞比例为２％～８％＿６ 。 ２．３ 表现线粒体的异质性研究表明，人一兔异种 ＮＴＥＳＣ表现人和兔线粒体ＤＮＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ， ｍｔＤＮＡ）共存的现象 。用人成纤维细胞与去核人卵 同于供体细胞（即患者自身的细胞），移植后可大大减少 免疫排斥反应，从而为移植医学的研究开辟了一条重要 途径。对于患有线粒体疾病的人来说，可用其体细胞进 行核移植，来获得其自身的ＮＴＥＳＣ进行细胞移植治疗。 尽管患者的ｍｔＤＮＡ存在异常，但移植用ＮＴＥＳＣ中绝大 多数ｍｔＤＮＡ来自卵母细胞，用这样的ＮＴＥＳＣ进行细胞 治疗，为挽救因ｍｔＤＮＡ突变引起的细胞代谢功能异常 母细胞进行融合，并对卵母细胞去核、融合、激活方案 进行优化，可获得人ＮＴＥＳＣ。这种人ＮＴＥＳＣ的核基因 组来自核供体细胞，而绝大多数ｍｔＤＮＡ来自卵母细 胞，也就是说人ＮＴＥＳＣ具有线粒体的异质性。这一现 象是由于核供体细胞和去核卵母细胞融合过程中，供 体细胞ｍｔＤＮＡ一同转移进克隆胚胎的缘故 。 ３ ＮＴＥＳＣ的应用 ３．１ 用于胚胎嵌合研究 ＮＴＥＳＣ能无限增殖，又具有 分化的潜能，这些特性使ＮＴＥＳＣ在胚胎嵌合研究上有 重要应用。将小鼠ＮＴＥＳＣ注人二倍体囊胚的囊胚腔 中，可得到嵌合体小鼠。后代小鼠的细胞来自ＮＴＥＳＣ 和宿主二倍体囊胚。将小鼠ＮＴＥＳＣ注入四倍体囊胚 中，也能得到小鼠后代，但这种后代的细胞来自 ＮＴＥＳＣ 。ＮＴＥＳＣ既可用正常小鼠来制备，也可由突 变小鼠来获得。雌雄同体不育性突变小鼠有精巢和卵 巢，具有一条异常Ｙ染色体，不能形成生殖细胞，因而 是不育的。这种不育性突变小鼠对于发育生物学的研 究具有重要意义，但通过核移植方法对这种小鼠进行 克隆难以成功。若先用这种小鼠的尾尖细胞进行核移 植，从克隆囊胚中获得ＮＴＥＳＣ，再用ＮＴＥＳＣ进行核移 植，也不能产生克隆后代。如果将ＮＴＥＳＣ注入二倍体 受精囊胚，可得到嵌合体后代。在嵌合体小鼠中，来自 ＮＴＥＳＣ的精子生发细胞能产生含ｘ染色体的精子，受 精后产生雌性后代，但精子生发细胞不能将异常Ｙ染 色体传递到下一代中，因此不能产生雄性不育小鼠。 若通过四倍体胚胎嵌合的方法，将ＮＴＥＳＣ注入四倍体 囊胚的囊胚腔中，可产生来自ＮＴＥＳＣ的后代，它们有 异常Ｙ染色体，不能产生生殖细胞，是不育的 。 ３．２ 用于细胞植入法疾病治疗研究 ＮＴＥＳＣ能分化 成其他类型的细胞，从而用于细胞治疗研究。将源自 小鼠成纤维细胞的ＮＴＥＳＣ植入患糖尿病的小鼠后， ＮＴＥＳＣ能分化成胰腺Ｂ细胞，能对葡萄糖刺激发生反 应，释放胰岛素，从而使患病小鼠的血糖水平恢复正 常 。用自然杀伤Ｔ细胞作核供体进行核移植，得到 的ＮＴＥＳＣ能分化成ＮＫＴ细胞。将这些ＮＫＴ细胞注射 进小鼠中，这些细胞在小鼠体内产生的干扰素＾ｙ能抑 制接种的肿瘤细胞生长 。 ４结语 用患者自身的细胞进行核移植，可从后续工作中获 的患者提供了一种新的方法。但是，需要特别指出，为 了制备人ＮＴＥＳＣ需要获得捐赠人卵母细胞时，要严格 履行知情同意原则，而且在获得克隆胚胎后，更要严格 防止将用于制备ＮＴＥＳＣ的胚胎用于克隆人。另外， ｔ ＮＴＥＳＣ应用于移植治疗的安全性也需要进一步研究。 主要参考文献 ［１］ＷＡＫＡＹＡＭＡ Ｓ，ＪＡＫＴ ＭＬ，ＳＵＺＵＫＩ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｉｌｓ ｔｏ ｔｈｏｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ ｍｏｕｓｅ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ［Ｊ］．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００６，２４（９）： ２０２３—２０３３． ［２］ＢＯＩＡＮＩ Ｍ，ＧＥＮＴＩＬＥ Ｌ，ＧＡＭＢＬＥＳ ＶＶ，ｅｔ ａ１．Ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｐｒｏｇ－ ｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒ Ｏｃｔ４ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｃｌｏｎｅｓ： ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｏｔｅｎｔｉｌａｓ ｉｎ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ ［Ｊ］．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００５，２３（８）：１０８９—１１０４． ［３］ＴＡＣＨＩＢＡＮＡ Ｍ，ＡＭＡＴＯ Ｐ，ＳＰＡＲＭＡＮ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｂｙ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ［Ｊ］． Ｃｅｌｌ，２０１３，１５３（６）：１２２８—１２３８． ［４］ＣＨＥＮ Ｙ，ＨＥ ＺＸ，ＬＩＵ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｎｕｃｌｅｉ ｉｎｔｏ ｒａｂｂｉｔ ｏｏｃｙｔｅｓ ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅｒａｃｈ，２００３，１３（４）：２５１—２６３． ［５］ＪＩＡＮＧ Ｗ，ＢＡＩ ｚ，ＺＨＡＮＧ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，２００８，５１（９）：１６７１—１６７９． ［６］ＨＩＫＩＣＨＩ Ｔ，ＷＡＫＡＹＡＭＡ Ｓ，ＭＩＺＵＴＡＮＩ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉ— ａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ［Ｊ］。Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００７，２５（１）：４６—５３． ［７］ＢＲＡＭＢＲＩＮＫ Ｔ，ＨＯＣＨＥＤＬＩＮＧＥＲ Ｋ，ＢＥＬＬ Ｇ，ｅｔ ａ１．ＥＳ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ ａｒｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ０ｎａＵｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｎｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，２００６，１０３ （４）：９３３—９３８． ［８］ＷＡＫＡＹＡＭＡ Ｓ，ＫＩＳＨＩＧＡＭＩ Ｓ，ＶＡＮ ＴＨＵＡＮ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｐａｇ— ａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｎｆｅｒｔｉｌｅ ｈｅｒｍａｐｈｒｏｄｉｔｅ ｍｏｕｓｅ ｌａｃｋｉｎｇ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆＡｍｅｒｉｃａ，２００５，１０２（１）：２９—３３． ［９］ＷＡＫＡＯ Ｈ，ＷＡＫＡＯ Ｒ，ＳＡＫＡＴＡ Ｓ，ｅｔ ａ１ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｕｓｉｎｇ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ［Ｊ］．ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ，２００８，２２（７）： ２２２３—２２３１．
