三氯生对雄斑马鱼鳃抗氧化相关基因表达的影响

体长为 1.5-2.1 cm 的斑马鱼 Danio rerio 幼鱼分别暴露在 0 对照组)、17.0 pug*L_\\34.0 |xg*L_1 和 68.0L1 TCS溶液中42 d后，利用普通PCR和RT-qPCR技术检测雄斑马鱼鲍组织抗氧化相关基因的表达水平。结

果表明:在三种浓度TCS处理中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(C477)和谷胱甘肽过氧化物酶(G氏)及金

属硫蛋白-2(M&2)基因表达量均下调,G/Wa基因的表达水平在68.0 pig-L-1 TCS浓度组显著下调(P<0.05),

SOD、CA T和sMT-B基因的表达水平在34.0憾・L\"和68.0 jxg-L-1 TCS组极显著下调(P<0.01) ,MT-2基因在各 TCS浓度组中均表现极显著下调(PvO.Ol)。本研究结果表明,TCS抑制了雄斑马鱼鲍组织中抗氧化相关基因的

表达，对雄斑马鱼鲍组织抗氧化防御系统造成了一定程度的损伤。关键词:三氯生;雄斑马鱼;抗氧化基因;普通PCR；RT-qPCR中图分类号:S917 文献标志码:AEffect of Triclosan on Expression of Genes Related to Antioxidant in Gill of Male ZebrafishBardo rerioGUO Xiangmeng, ZHENG Fangfang, WANG Fan(Luoyang Normal University, Luoyang 471934, China)Abstract: Juvenile zebrafish (Danio rerio) with body length of 1.5 - 2.1 cm was exposed to various concentrations of triclosan(TCS)

(0

17.0|jLg・L-i, 34.0 |jig • L1 and 6&0 |±g • L\"1) for 42 d and the expression of genes related to antioxidant in gill of the male ze­

brafish were investigated by semi-static water exposure method and by normal PCR and RT-qPCR techniques in order to explore an­

tioxidant defense molecular mechanism of triclosan on bony fish gill tissue. It is showed that the expression levels of genes of superox­ide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPX) and metallothionein-2 {MT-2) were down-regulated in TCS

treated groups compared with those in the control group, with significantly down-regulated GPxla gene expression in the 6&0 |xg • L1

group (P< 0.05), very significantly down-regulated expression levels ofSOD, CA T and sMT-B genes in the 34.0 |±g*L_1 and 68.0 |±g •!/ groups (P< 0.01), and significantly down-regulated MT-2 gene in three different TCS concentrations groups (P v 0.01). The findings

indicate that TCS inhibits mRNAs expression of antioxidant related genes, and can cause some degree of damage to the antioxidant de­fense system in gill tissues of male zebrafish.Key words: triclosan; male zebrafish; antioxidant genes; normal PCR; real-time quantitative PCR三氯生(Triclosan, TCS)是广泛应用于化妆品、 纺织品、家用清洁剂和消毒剂等中的抗菌剂，大量 使用不可避免地释放到水环境中，在城市排水系

学研究受到越来越多的关注⑷。已有研究表明,TCS 具有生物蓄积性、通过食物链传递性和较强的稳定

性o TCS对斑马鱼Danio rerio和红白鲫Carassius

统、污水处理系统、污泥、河流等水体中均可检测 到LT。调査发现，虽然TCS在水环境中分布浓度较

auraius血红细胞微核率和核异常率的显著影响，表 明其对硬骨鲤科鱼类具有潜在的遗传毒性［旳；长期

低，毒性作用也不明显，但在一定条件下其可以转 的TCS暴露显著改变了黄河鲤Cyprinus carpio性 激素和卵黄蛋白原、斑马鱼甲状腺激素的产生，表

化为毒性更强物质，因此,TCS的环境行为和毒理收稿日期：2019-10-22基金项目：国家自然科学基金⑶971524);NSFC-河南人才培养联合基金(U1504303).

作者简介:郭向萌，男,硕士,高级实验师,从事水生态学研究.E-mail ： 2351*********** 通信作者:王凡，男，博士,副教授，从事水生态毒理学研究.E-mail: *******************6期郭向萌等:三氯生对雄斑马鱼酿抗氧化相关基因表达的影响•35-明TCS对鱼类具有内分泌干扰效应[7T]°TCS能够不 同程度地诱导或抑制剑尾鱼Xiphophorus helleri肝 脏相关代谢酶及其mRNA的表达，表明TCS对鱼类

的代谢也产生一定程度的影响问。迄今为止,TCS对 硬骨鱼类抗氧化影响的分子机制研究较少。斑马鱼是一种与人类基因高度同源，易饲养、

繁殖快、生命周期短、对污染物的作用敏感的模式 生物，可应用于水质监测、毒理学、药理学等科学研

究中⑴】。鲍是鱼类直接与水环境接触的主要呼吸器

官，可以更加直接反应出污染物对鱼类的毒性作 用卫]。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和

谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）是生物体内主要的抗氧 化酶类。金属硫蛋白-2（MT-2）和s金属硫蛋白-B

（sMT-B）清除自由基的能力远远超过抗氧化酶类。 因此，本研究通过探究TCS对斑马鱼鲍组织SOD、

CAT、GP%、MT-2和sMT-B基因表达的影响，有助

于揭示TCS对斑马鱼鲍组织影响的分子机制，可为 水生生物保护和维护水生态平衡提供科学依据,为

TCS对动物及人类的潜在危害提供有价值的参考。1材料与方法1.1材料试验用斑马鱼购自上海诚信渔场，体长为

1.5-2.1 cm,选用健康、行为敏捷、规格均匀的个体

暂养于60 L的水族箱中，水量20 L,温度为（22 ±3）七,pH为（6.9 ±0.2）,连续不间断充氧。每天投喂 两次,用曝气72 h的自来水及时换水,并清理缸内 斑马鱼残饵及粪便，暂养7 d后开始正式实验。试验用试剂有：三氯生（美国Sigma公司）、总

RNA极速提取试剂盒（上海飞捷生物技术有限公 司）、RNA反转录试剂盒（东洋纺生物科技有限公 司）、2 X Taq MasterMix（北京康为世纪生物科技有限

公司Gold View I 型核酸染色剂、Bestar SybrGreen

qPCR mastermix（德国DBI公司）、二甲基亚砚溶剂

（天津紫明化工有限公司）、基因引物（华大基因公

司）、琼脂糖、Loading buffer染料等。1.2方法资料表明,TCS对斑马鱼96 h半致死浓度

（LCJ为340 |xg-L-1[13]o以此为依据，设置对照和3

个 TCS 浓度处理组：0 p,g-L-\\17.0 临・1/、34.0 fig-

L1和68.0 ^g-L-'o随机取暂养后的斑马鱼幼鱼100 尾，置于各浓度组水族箱中，每组2个平行。每个水

族箱用水量20 L,以半静态水体暴露法对斑马鱼进 行连续处理42 d。整个试验期间其他条件同暂养。TCS处理42 d后,解剖行动敏捷、生长状况良

好且体表完好的斑马鱼。每个浓度斑马鱼均分为五

组，每组取出5尾斑马鱼鲍，混合样为一个样本，取 样后迅速保存在超低温冰箱中备用。1.3凋亡相关基因表达的检测1.3.1引物序列13-actin （内参）、SOD、GPxla、CAT、sMT-B 和

MT_2基因的引物序列（表1）来自于相关报道陛叫表1实时荧光定量PCR所用基因的特异性引物及其序列Tab. 1 Primers and their sequences used for real-time PCR引物Primers序列 Sequences(5,-3\")p—actinCGGAATCCACCAAACCACCTAATCTCCITCTGCATCCTGTGASODGGCCAACCGATAGTGITAGACCAGCGITGCCAGTTTTTAGGPxlaACCTGTCCGCGAAACTATTGTGACTGTTGTGCCTCAAAGCCATAGGGCAACTGGGATCTTACATITATGGGACCAGACCITGGsMT-BTGCTCCAAATCTGGATCTTGGCAGTCCTTCTTGCCCTrACMT-2AGACTGGAACTTGCAACTGTGGTCAGCTGGAGCCACAGGAATT1.3.2 RNA的提取与反转录按照总RNA极速抽提试剂盒提供的方法，提 取每个雄斑马鱼的鲍组织混合样本。对提取出的

RNA用凝胶电泳分析其质量,用超微量分光光度计

检测其纯度和浓度。对质量好、纯度高且浓度适宜

的RNA样本进行反转录反应。1.3.3 普通 PCR将反转录得到的cDNA、目的基因或内参基因

的上下游引物、2 X Taq Master Mix及无菌水制备25

|iL的普通PCR反应体系。然后，将反应体系充分

混匀,根据普通PCR步骤进行扩增反应。琼脂糖凝 胶电泳检测PCR扩增情况。1.3.4实时荧光定量PCR为了验证目的基因（SOD、GPxla、CAT、sMT-B 和MT-2）的扩增效率与内参基因（/3-actin）的扩增

效率是否满足实时荧光PCR相对定量2-aa\"法的

要求，将上述目的基因引物与内参基因引物同时做 标准曲线分析。结果发现：目的基因和内参基因的

•36*水产学杂志第33卷扩增效率都接近100%,可以用实时荧光定量中的

2-A4法进行目的基因的相对表达量分析。将反转录获得的样本的cDNA、目的基因和内 参基因的上下游引物、Bestar SybrGreen qPCR mas­

termix 及无菌水制备20 |jlL的实时荧光定量PCR 反应体系,充分混匀后,放入实时荧光定量PCR仪

中进行扩增。1.4数据分析分析实时荧光定量PCR反应后的Cq值，利用

图1不同TCS浓度组斑马鱼鲍基因表达情况

Fig. 1 Gene expression in gill of zebrafish {Danio rerio)

exposed to various concentrations of TCS2-心法计算目的基因的相对鈕皿表达量，然后 应用SPSS13.0软件对目的基因的相对mRNA表达

注 za,p-actin;\\),SOD;c9GPxla;d9CAT;e9sMT-B;f,MT-2量进行单因素方差分析。数据用X ± SD（平均值±

标准差）表示，采用LSD法分析各浓度组和对照组

2.2 TCS对雄斑马鱼鲤抗氧化酶相关基因表达定

量分析为了验证TCS对斑马鱼鲍的各种抗氧化酶相

之间的差异,P<0.05表示差异显著;P<0.01表示差 异极显著。2结果与分析关基因的表达量的影响，采用RT-qPCR法检测并 分析处理组的表达与对照之间的差异性。如图2所

2.1目的基因和内参基因的普通PCR反应首先分析每个TCS浓度组SOD、GP%la、CAT、

示,S0D、GPxla和C4T基因表达均有下调趋势。与 对照组相比,SOD基因在34.0 ixg-L-1和68.0憾・1/

sMT-B和MT-2基因与内参基因灰度值之比。34.0

IJig-L-1和68.0 jxg-L-1 TCS浓度组斑马鱼的SOD基 因与内参基因的灰度比明显下降，表明其表达下调 （图1）。其他目的基因主要表现为:17.0 iJig-L-1浓度 组基因的表达水平无明显变化,34.0

浓度组极显著下调,下调值分别为50.6%和77.7%O

G用％基因在68.0 ixg-L-1浓度组显著下调,下调了

58.4%o C4T基因在 34.0 ixg-L-1 和 68.0 憾・1/ 浓度

组极显著下调（94.1%和90.2%）02.3 TCS对雄性斑马鱼鲤金属硫蛋白相关基因表

达定量分析和68.0 jxg-L-1组表达水平下调；17.0 iJig-L-1浓度组

G471基因的表达水平无明显变化，34.0 pig-L-1和

金属硫蛋白相关基因的实时定量分析结果如 图3所示。由图3可知：34.0 ixg-L-1和68.0憾・1/ 浓度组斑马鱼的sMT-B基因表达量极显著下调，依

68.0 ^g-L-1浓度组表达水平下调；17.0 Fig-L-1浓度

组sMT-B基因的表达水平无明显变化,34.0 iJig-L-1 和68.0 ixg-L-1浓度组表达水平下调；17.0 ixg-L-1浓 度组MT-2基因的表达水平无明显变化,34.0

次下调65.4%和65.4%O MT-2基因表达量随着TCS 浓度的增加有不同程度的下调，依次下调了 95.1%,

L1和68.0 ixg-L-1浓度组表达水平下调（图l）o1.1.0.0.78.5%和 56.7%O*

5 1.01. CJ 5

5

0 5 0

si®*

5 l.0l.a 5 o.0

CAT0.0 17.0 34.0 68.0.034.o

用

68.VN0.0 17.0 34.0 6&0TCS 浓度 /pig-L-1TCS 浓度 /pLg-L-1图2不同TCS浓度组斑马鱼鲤抗氧化酶相关基因mRNA的表达Fig. 2 mRNA expression of genes related to antioxidant enzyme in gill of male zebrafish (Danio rerio) exposed to various

concentrations of TCS注:*表示与对照组相比差异显著；**表示与对照组相比差异极显著，下同Note: * indicates significant difference compared to the control group ( *P<0.05 ), ** indicates very significant difference compared to the control group (**P<

0.01), et sequentia6期5L 0

郭向萌等:三氯生对雄斑马鱼鲫抗氧化相关基因表达的影响•37-*盘蛊

1.C55

50. 0.O

O.0

TCS 浓度 /ug-L-1图3不同TCS浓度组斑马鱼鲤金属硫蛋白基因H1RNA的表达Fig. 3 mRNA expression of metallothionein gene in gill of male zebrafish {Danio rerio) exposed to various concentrationsof TCS注:*•表示与对照组相比差异极显著3讨论生物体抗氧化系统与生物的免疫水平密切相 关，因此，抗氧化类物质（抗氧化酶类和金属硫蛋白

浓度组GPxla的表达量在下调，且在68.0 jig-L-1浓

度组显著下调，进一步证实了 H2O2和其他的过氧化 物在鲍组织中过剩,致使鲍组织氧化系统和抗氧化 系统失衡，造成对鲍组织的氧化性损伤。已有研究

类）可作为生物体的非特异性免疫指标［叭。SOD、

报道,理①能使斑马鱼SOD基因表达下调［釦,全氟 辛烷磺酸类物质可使剑尾鱼SOD基因表达下调［21】； 珞使草鱼 Ctenopharyngodon idellus 鲍内 GPx 活性 先增高后降低，且长时间暴露会导致GPx基因表达

CAT和GPx是生物体内主要的抗氧化酶类,在应对 外界物理因素和化学因素刺激和清除生物体内自 由基中发挥重要作用。MT-2和sMT-B是生物体内 普遍存在的两种典型代表性的金属硫蛋白，清除自

降低［辺;悬浮物使褐牙鲫Para/jch班olivaceus幼鱼

由基的能力远超过抗氧化酶类。因此本实验研究了

C4『基因表达显著下调［约;底泥浸出液使脊尾白虾

Exop（daemon cariniccuida CAT酶活力及基因表达下 调跑。这些研究结果和本研究结果一致。TCS 对斑马鱼鲍 SOD、GPxla、CAT、sMT-B 和 MT-2

基因mRNA表达的影响。SOD基因表达产物为超氧化物歧化酶,能催化 超氧化物阴离子自由基，且歧化为过氧化氢（H2O2）

MT-2基因表达产物为金属硫蛋白-2,其为富 含半胱氨酸的短肽，能与机体氧自由基反应，清除

与。2,保护细胞免受氧自由基氧化损伤何。CAT是过

游离活性氧，来保护细胞防止氧化性损伤叫 因此,

氧化体中存在的氧化酶,主要将H2O2分解为理0和

当体内金属硫蛋白表达量降低，清除体内氧自由基 的效率降低，造成细胞的氧化损伤。本研究发现，在

。2,即将H2O2及其他过氧化物转变为无毒性产物［怕。

GPx基因表达产物为谷胱甘肽过氧化物酶,通过还

原性谷胱甘肽催化还原过氧化物和有机见02,保护

TCS各处理组中MT-2基因表达极显著下调，表明

MT-2比抗氧化酶更为敏感，也证实了中浓度组和 高浓度组的TCS已经使斑马鱼鲍各类氧自由基过 剩,造成鲍内的氧化体系与抗氧化体系失衡,斑马

细胞和其他如DNA、蛋白质及脂质体等敏感生物分 子免受氧自由基损伤两。GPxla是GPx家族成员之

一,能清除过氧化氢和脂肪酸过氧化氢［明。本研究 发现,暴露在34.0憾・!/和68.0 pLg-L1浓度的TCS 溶液42 d后,斑马鱼鲍组织SOD基因和C4T基因

鱼鲍产生了氧化性损伤。但尤日福等［如和王磊等囚］

的研究表明,镉使河蚌A nodonta woodiana和泥鍬

Misgurnus anguillicaudatus金属硫蛋白基因表达显 著升高，其原因可能是他们的研究中使用的污染物 浓度过小或者暴露时间过短,而本实验中斑马鱼暴

的表达显著下调，表明该浓度TCS刺激了斑马鱼鲍 组织，使超氧化物阴离子自由基增多,而此时SOD 要迅速清除过多的超氧阴离子自由基,SOD基因表

露时长达42 d,长时间胁迫已经致使鱼体内氧化系 统和抗氧化系统失衡。sMT-B也能清除生物体内氧

达下调,在清除过多的超氧阴离子自由基的同时会

导致H2O2和其他的过氧化物迅速增多,CAT要催

自由基，减轻氧化性损伤，同时与脑神经的一些生 理功能也有一定关系［叫 本次研究发现,TCS浓度 为 34.0 iJig-L-1 和 68.0 ixg-L-1 时,sMT-B 基因的表

化过剩的H2O2和过氧化物也会致使C4T基因表达 量降低。本研究也发现,34.0 ag-L-1和68.0 ixg-L1

•38-水产学杂志第33卷达极显著降低，进一步证实上述结果的可靠性。综上所述,TCS对雄性斑马鱼鲍组织的抗氧化

基因表达造成一定影响，引起SOD、GP:xla、CAT、

sMT-B和MT-2等基因表达量降低,体内的氧自由 基不能被有效清除，产生氧化性损伤，这将有助于 揭示TCS对斑马鱼影响的分子机制。参考文献[1 ] Bedoux G, Roig B, Thomas 0, et al. Occurrence and toxici­

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