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微波辅助提取黑米中黑色素的研究
罗建光
（江苏食品药品职业技术学院 食品学院，江苏淮安 223003）
摘 要：研究微波辅助提取黑米中黑色素工艺。试验最佳工艺为提取温度70 ℃、乙醇溶液70 %、微波功率320 W、微波辐照时间120 s、料液比1∶25(g/mL)，微波辅助提取提高了黑米中黑色素的得率且操作时间短、节省试剂用量、污染小、安全。关键词：高效液相色谱；微波；黑色素
Study on microwave assisted extraction of melanin from black rice
LUO Jian-guang
(School of Food, Jiangsu Food & Pharmaceutical Science College, Huai'an 223003, Jiangsu, China)Abstract: The technology of microwave assisted extraction of melanin from black rice was studied. The optimum extraction conditions were as follows: extraction temperature 70 ℃, ethanol solution 70 %, microwave power 320 W, microwave irradiation time 120 s, ratio of material to liquid 1∶25(g/mL), microwave-assisted extraction improved the yield of melanin in black rice, shortened the operation time, saved the amount of reagents, less pollution and safety.
Key words: high performance liquid chromatography; microwave; melanin
中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文章编号：1008-9578（2018）11-0073-03
黑米在我国有着悠久的种植历史，其中含有丰富的粗蛋白、铁、铜、锌等微量元素，对头晕、贫血、腰膝劳损、手脚无力有着良好的治疗作用。并且它的米糠中含有大量的黑色素[1]。黑色素作为一种纯天然食用色素，安全性高、对人体无害、价格低廉[2]，其营养价值高且有药用价值，在我国食品工业发展中有着很大的潜力[3]。
本文采用微波提取技术，以黑米为原料，探索一种符合现代食品生产需要的黑色素提取方法，为以后的工业化生产黑米黑色素提供试验依据[4-6]。1 材料与方法
1.1 试验材料及试剂
黑米：市售；黑色素标准储备液制备：准确称取黑色素标准品0.100 0 mg，溶于1.00 mL1%盐酸甲醇溶液中，配成1 mg/mL的标准储备液，保存备用；黑色素标准使用液制备：取黑色素标准储备液稀释制备成黑色素浓度为2、10、20、50、100 µg/mL的标准系列工作溶液，保存备用；无水乙醇、盐酸、甲醇：分析纯。1.2 主要试验仪器
RE-52AA旋转蒸发仪型：上海亚荣生化仪器厂；FA1604N 型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；ZK-82 B 型真空干燥箱：上海市实验仪器厂；TDB4A 型台式离心机：长沙英泰仪器有限公司；D8023C6TL-K4C 型家用微波炉：广东格
兰仕集团有限公司；Waters高效液相色谱仪：美国waters公司。1.3 试验方法
1.3.1 原料与处理
准确称取1.000 0 g样品去除其中的杂质，将黑米粉碎过0.425 mm筛，经干燥后取出放入干燥的试剂瓶中备用。1.3.2 提取工艺流程
取出处理后的1.000 0 g黑米样品加入70 %乙醇溶液20 mL，摇匀。在微波功率320 W，温度70 ℃的条件下辐照120 s，取出过滤，利用旋转蒸发仪减压浓缩回收提取剂，将上述提取后的样品置于真空干燥箱中干燥2 h，保存提取后的样品。
1.3.3 色谱条件
色谱柱：C18柱（长：150mm×4.6mm，5 µm)；流动相为甲醇∶水（体积比75∶25 ）；流速为1.0 mL/min；检验波长为2 nm；进样量为20 µL。
1.3.4 标准曲线的绘制
使用已经配制好的黑色素标准系列工作液，在已设置好的色谱条件下，依次进样浓度为2、10、20、50、100 µg/mL的黑色素标准溶液20 µL，以黑色素的浓度（µg/mL)为横坐标，峰面积（mAu）为纵坐标绘制标准曲线。
收稿日期：2018-04-17
作者简介：罗建光（1968—） ， 博士， 副教授， 研究方向为食品生物技术。
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1.3.5 样品的测定
将上述处理好的黑色素样品，置于20 mL棕色容量瓶中，加入5 mL 1%盐酸，用甲醇溶液定容至刻度，摇匀，在拟定的色谱条件下进样20 µL测定相应的峰面积。样品中黑色素含量计算公式如式（1）。
（1）
式中：X为样品中黑色素的含量，mg/g；A为提取
液中黑色素的质量浓度，µg/mL； m为样品的称取量，g； V1为初次定容体积，mL； V2为过固相萃取柱溶液的体积，µL。
本试验还对提取剂的浓度、温度、微波功率、微波辐照时间、料液比进行了优化。2 结果与讨论2.1 标准工作曲线
由图1可以看出，黑色素的浓度在0~100 µg/mL范围内，与峰面积呈良好的线性关系。得到的回归方程为y= 185.09X+42.545，R2= 0.999 92，检出限0.01 mg/mL。根据公式计算得黑米中黑色素含量为48.5 mg/g。
200001800016000X14000$P12000⿃10000䴶800060004000y = 185.09x+42.54520000020406080100120䖯ḋ⌧(µg/mL图1 黑色素标准曲线
2.2 精密度和回收率试验
取质量浓度为25 µg/mL 的黑色素标准储备液，按1.3.3中的色谱条件重复进样6次，测出色谱峰的面积，结果见表1。
表1 黑色素精密度试验
按1.3.3中的色谱条件进行分析，分别进样6次，并计算回收率，具体数值见表2。
表2 黑色素的回收率试验
由表2、3可知，变异系数为1.31%，平均回收率为98.31%，精密度和准确度都符合国标要求，可用于黑米中黑色素含量测定。2.3 提取条件的优化2.3.1 提取剂浓度的选择
在70℃的温度下分别采用40 %、50 %、60%、70 %、80 %的乙醇溶液于320 W的微波下辐照120 s，料液比为1∶25 (g/mL)，测定乙醇浓度对黑色素得率的影响，结果见图2。
6050JJP40⥛30㋴㡆20咥10040 50 60 70 80Э䝛⿃%图2 提取剂浓度对得率的影响
如图2所示，乙醇浓度对黑色素提取影响显著。随着乙醇浓度的增加，黑米中黑色素的得率也增加，在乙醇浓度40 %~60 %之间黑色素得率增长较为明显，在60 %~80 %之间增长较为缓慢，原因可能是因为随着乙醇浓度的升高，一些醇溶性杂质、亲脂性强的成分溶出量也增加，干扰因素随之也增大，从而导致提取效果下降。综合考虑选用70 %乙醇较为合适。2.3.2 温度对得率的影响
分别在50、60、70、80、90℃的温度下采用70 %的乙醇溶液于320 W的微波下辐照120 s，料液比为1∶25 (g/mL)，测定温度对黑色素得率的影响，结果见表4。
表3 温度对黑色素得率的影响
如表3所示，温度对得率影响较大，随着温度
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的上升得率逐渐升高，在50~70 ℃之间黑色素得率增长较为明显，在70 ℃时达到最高值，然后随着温度的升高，得率下降，在70~90 ℃之间得率明显降低。因为温度升高，分子运动速度加快，使黑色素容易从细胞转移到溶剂中，但温度过高可能会导致活性成分的湿热降解或异构化，使提取率降低。综合考虑选用70℃较为合适。2.3.3 微波功率的选择
于70℃的温度下，采用70 %的乙醇溶液分别在160、320、480、0、800 W的微波下辐照120 s，料液比为1∶25 (g/mL)，测定微波功率对黑色素得率的影响，结果见图4。
6050)g/g40m(/⥛30㋴20㡆咥1001603204800800⊶⥛:图3 微波功率对黑色素得率的影响
如图3所示，微波功率在160~320 W之间黑色素得率增长较为明显，在320~800 W之间得率明显降低。微波可提高得率，但处理过强或过弱对提取工艺都不利。过强导致提取体系温度过高，而造成色素的破坏，过弱则达不到提高提取率的目的，综合考虑选用320 W较为合适。2.3.4 微波辐照时间对得率的影响
在70℃的温度下，采用70 %的乙醇溶液在320 W的微波下分别辐照30、60、90、120、150 s，料液比为1∶25(g/mL)，测定辐照时间对黑色素得率的影响，结果见表4。
表4 微波辐照时间对得率的影响
如表4所示，微波辐照时间对提取效率具有明显的影响，微波辐照时间在30~120s之间黑色素得率增长较为明显，在120 s时达到最大值，在120~150 s之间得率明显降低，微波处理辐照时间不同，对基质材料结构的影响不同，目标成分提取的动态特性也不同，综合考虑选用120 s较为合适。2.3.5 料液比对得率的影响
在70℃的温度下采用70 %的乙醇溶液在320 W的微波下辐照120 s，分别用料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 (g/mL)进行处理，
测定料液比对黑色素得率的影响，结果见图4。
6050)g/gm(40/⥛㋴30㡆咥201001∶101∶151∶201∶251∶30⎆↨/(g/mL)图4 料液比对得率的影响
如图4所示，料液比在1∶10~1∶15(g/mL)之间黑色素得率增长较为明显，在1∶15~1∶30(g/mL)之间得率增长较为缓慢。一般来说，溶剂用量越大，提取物质的得率也就越大。但当溶剂用量达到一定值后，得率趋于平缓，此时提取物质已基本提取完全，且过多溶剂会造成溶剂和能源的浪费，并给后续的浓缩工作带来困难，从降低成本等综合考虑选用1∶25(g/mL)较为合适。3 结论
本文以黑米为原料研究黑色素的得率，采用高效液相色谱法测定黑米中黑色素的含量，结果测得样品黑色素含量为48.5 mg/g，本实验变异系数为1.31%，平均回收率为98.31%。线性范围为0~100 µg/mL，检出限为0.0 1mg/mL。结果符合国标要求，此方法可行。
试验探讨的最佳提取条件为在70℃的温度下采用70 %的乙醇溶液提取样品中黑色素，在320 W的微波下辐照120 s，料液比为1∶25(g/mL)时提取率最佳。本实验在微波辅助下与传统方法相比提高了黑米中黑色素的得率且操作时间短、节省试剂用量、污染小、保护环境并适用于大规模生产。试验所用方法简单、灵敏度及精密度高、回收率好。
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