真题答题(大题,须稍加整理)

PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动温度的仪器。

PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸。 (!)变性（模板DNA解旋）

模板DNA经加热至90℃以上。一定时间后，使模板DNA双链解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。

(2)复性（退火）

模板DNA经加热变性成单链后，温度降到50℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

(3)延伸

DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。

循环数 变性 复性 延伸 第一次（预变性） 94°C，30s － － 30次 94℃，20s 52℃，20s 72℃，20s 最后一次（保温） 72℃，30s (2)琼脂糖凝胶电泳

DNA在电厂作用下，可以由电源的负极向正极泳动，泳动的速度与DNA片段的长度成负相关，与电压强度成正比，因此可以分离不同长度的DNA。在有DNA marker（不同已知碱基对大小的DNA片段的混合物）的条件下，由于不同碱基大小的DNA片段在琼脂糖凝胶上涌动的速度不同，因此电泳完毕后会出现在胶块的不同位置。通过将扩增出的DNA片段与已知的

条带做比较，可以大概推测出该片段的碱基对的大小。如果要进一步检测其大小，可以换另外规格的DNA marker 继续电泳。核酸荧光染料可以与DNA嵌合，一起电泳，DNA图谱观察仪可以激发特定的蓝色光源，荧光染料在该光照射下可见到荧光，荧光的亮度与DNA大小成正比。

三、实验仪器及试剂

7种PCR组分 微量可调移液器 离心管 PCR仪 水平电泳槽 电泳仪电源 紫外分光光度计 250ml锥形瓶(封口膜) 记号笔 卫生纸

四、实验步骤

1、DNA体外扩增

(1) 将所有试剂管瞬时离心一次（4000r/min,1min），使管壁没有残留药品，在引物I 和引物II的离心管内用移液器各加入40ul双蒸水（ddH2O），混匀后瞬时离心一次。所有的离心管都摆到双面板上。

(2)向装有Taq DNA 聚合酶的离心管按下表加入以下成分： 10x Buffer MgCl2 dNTP mixture 上游引物(引物I) 下游引物(引物II) 模板DNA ddH2O 50 μL 50 μL 20μL 25μL 25 μL 25 μL 290μL 原有的Taq DNA 聚合酶有15ul，此时混合液体系共计500ul,此步骤由第一、二组同学合作完成。（在实验老师的监督指导下操作，确保此后其他同学的实验顺利进行）

(3)共分25组，第一、二组的同学并入其他小组进行实验。每组取20ul的上述混合液于0.5ml的离心管中，加入15ul的液体石蜡封闭体系，以防止在加热过程中蒸发。

(4) 对自己组的离心管上进行标记之后，放到PCR仪上进行DNA扩增。 2、琼脂糖凝胶电泳检测DNA

（1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。

（2）配制浓度为1%（1 g/100 mL）的琼脂糖凝胶2块。在锥形瓶中，称取1g的琼脂糖粉，加入100ml 1x电泳缓冲液，用封口膜封住瓶口后在微波炉内加热，使琼脂糖粉熔化，然后冷却至60 ℃，倒入电泳槽中（每块胶50ml），插好梳子，待其凝固。（电泳槽首先用透明胶带将两端封住再进行倒胶）

（3）待胶凝固后，去掉胶带纸，小心移去梳子，注意不要破坏加样孔。将倒胶槽至于水平电泳槽内，梳井（点样孔）一端朝负极方向。向电泳槽中缓缓倒入1x电泳缓冲液，以没过胶面2 mm为宜。

（5）将80ul的6xLoading Buffer 加入到80ul的核酸荧光染料中，按1:1比例混合。 （6）移液器头插入到扩增出的样品离心管的底部，吸取20ul样品于另一0.5ml的离心管中，注意不要吸到液体石蜡，再加1ul的染料混合液，充分振荡混匀。用移液器吸取10ul缓慢加入梳井内，头抵到梳井口，以防止样液被缓冲液冲散，此外，为防止手抖将凝胶破坏，可以用左手扶住右手的手腕。

（6）盖上电泳槽盖，接通电源，电压为80 V，电流最大。 （7）当指示剂移动到凝胶中间时，断开电源，终止电泳。

（8）取出凝胶块，在DNA图谱观察仪中观察电泳带及其位置，判断扩增产物的情况。 3、紫外分光光度计检测DNA含量

（1）最后1组取2ulPCR反应液，加入98ul蒸馏水，将样品稀释50倍。

（2）以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。 （3）加入DNA稀释液100ul至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。 （4）根据下面的公式计算DNA含量：

DNA含量（ul/ml）=50*（260nm的读数）x稀释倍数

五、注意事项

1 离心机上盖没有锁，在离心机运转时，转速最高可达16000r/min，如果这时打开离心机上盖，里面的离心管就会甩出，对人身造成危险，切忌等全部停下来之后再打开上盖取出离心管。另外，离心管一定要对称放置。

2 水平电泳槽在电泳时一定要盖上上盖，此时的缓冲液电压可以达到80V，大大超过了人体的安全电压，切忌不能用手触碰缓冲液或者是电源两端接头。

简答题

1. 氨基酸脱氨后产生的氨和α-酮酸有哪些主要的去路？

答：氨基酸经脱氨基后所生成的氨进入血液，由丙氨酸及谷氨酰胺两种形式运输，大部分在肝中合成尿素，只有少部分在肾以铵盐形式由尿排出。氨基酸经脱氨基后所生成的α-酮酸可以进一步代谢，主要有三条代谢途径。

（1）经氨基化生成非必需氨基酸：哺乳类动物体内的一些非必需氨基酸一般通过α-酮酸氨基化而生成。

（2）转变成糖及脂类：α-酮酸可以转变为糖和脂肪。分别用各种不同的氨基酸喂养人工造成糖尿病的犬时发现，大多数氨基酸可使尿中葡萄糖的排出量增加，少数几种（异亮、

苯丙、酪、苏及色氨酸）可使尿中葡萄糖和酮体的量都增加，而亮氨酸和赖氨酸只能使尿中酮体的排出量增加，因此将氨基酸分为三大类：生糖氨基酸、生酮氨基酸和生糖兼生酮氨基酸。

（3）氧化供能：α-酮酸在体内可通过三羧酸循环和生物氧化体系，彻底氧化为CO2和H2O，同时释放能量供生理活动的需要。 2氨在血液中是如何转运的？

.答：氨是有毒物质，各组织中产生的氨必须以无毒性的方式经血液运输到肝合成尿素或运到肾以铵盐的形式随尿排出，现已阐明，氨在血液中主要以丙氨酸及谷氨酰胺两种形式运输的。 （1）丙氨酸-葡萄糖循环：肌肉中的氨基酸经转氨基作用将氨基转给丙酮酸生成丙氨酸，丙氨酸经血液运到肝脏。在肝中，丙氨酸通过联合脱氨基作用，释放出氨，用于合成尿素。转氨后生成的丙酮酸经糖异生途径生成葡萄糖。葡萄糖由血液输送到肌组织，在肌组织中葡萄糖分解转变成丙酮酸，丙酮酸再接受氨基生成丙氨酸。丙氨酸和葡萄糖反复地在肌肉和肝脏之间进行氨的转运，所以将这一途径称为丙酮酸-葡萄糖循环。通过这个循环，即使肌肉中的NH3以无毒的丙氨酸形式运输到肝，同时，肝又为肌肉提供了生成丙酮酸的葡萄糖。由此具有重要的生理意义。

（2）谷氨酰胺的运氨作用：谷氨酰胺是另一种转运氨的形式，它主要从脑、肌肉等组织向肝或肾运氨。氨与谷氨酸在谷氨酰胺合成酶的催化下生成谷氨酰胺，并由血液运输到肝或肾，再经谷氨酰胺酶水解成谷氨酸和氨，氨在肝脏中可用于合成尿素，解除氨毒，在肾脏则与H+结合并以NH4+盐形式随尿排出。

3. 试述血氨的来源和去路。

答：体内氨的来源主要有三方面：氨基酸、胺类物质氧化分解产NH3；肠道吸收的NH3；肾小管上皮细胞产生的NH3。

（1）氨基酸脱氨基生成的氨是体内NH3的主要来源。胺类物质氧化分解也可产生NH3。

（2）由肠道吸收的NH3包括两部分：①氨基酸在肠道细菌作用下产生的氨②尿素经肠道细菌尿素酶水解产生的氨，肠道产NH3量较多，每日约4克。

（3）肾小管上皮细胞产生的NH3主要来自谷氨酰胺，谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的催化下水解成谷氨酸和NH3。这部分NH3分泌到肾小管管腔中与尿中的H+结合成NH4+,并以铵盐的形式随尿排出，对调节机体的酸碱平衡起重要作用。

氨的主要去路：

（1）氨主要在肝脏经尿素循环合成尿素。 （2）合成谷氨酰胺 （3）合成非必需氨基酸 4试述尿素合成的过程和特点。 .答：尿素合成的过程：

（1）氨基甲酰磷酸的合成：反应在线粒体中进行。氨可与CO2可在氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ（CPS-Ⅰ）的催化下，合成氨基甲酰磷酸。

（2）瓜氨酸的合成：反应在线粒体中进行。在氨基甲酰转移酶的催化下，氨基甲酰磷酸与鸟氨酸缩合生成瓜氨酸。

（3）精氨酸的合成：反应在胞液中分两步进行。首先，瓜氨酸在线粒体合成后，

被转运到线粒体外。在胞液中，在精氨酸代琥珀酸合成酶催化下，瓜氨酸与天冬氨酸反应生成精氨酸代琥珀酸，由ATP供能。其后，精氨酸代琥珀酸再经精氨酸代琥珀酸裂解酶催化，裂解成精氨酸及延胡索酸。

（4）精氨酸水解生成尿素：反应在胞液中进行。在胞液中，精氨酸受精氨酸酶的作用，水解生成尿素和鸟氨酸。鸟氨酸通过线粒体内膜载体转运再进入线粒体，并参与瓜氨酸合成。如此反复，完成尿素循环。

尿素合成的特点：鸟氨酸循环先在线粒体中进行，再在胞液中进行。每进行一次循环，就能合成一分子尿素，需要两分子的NH3和一分子CO2, 2分子NH3。一分子来自体内氨基酸脱氨基生成，另一个由天冬氨酸提供，而天冬氨酸又可由其它氨基酸通过转氨基生成。因此，尿素分子中的两分子NH3都是直接或间接来自于各种氨基酸。另外，每合成一分子尿素消耗3分子ATP，4 个高能磷酸键。

5. （1）何为一碳单位？写出四种体内重要的一碳单位基因。

（1）某些氨基酸在代谢过程中可以产生含有一个碳原子的基团，称为一碳单位。体内的一碳单位有：甲基（-CH3）, 亚甲基（-CH2-），次甲基（-CHO=），甲酰基（-CHO），亚氨甲基（-CH=NH）。

（2）一碳单位的辅酶是什么？又如何与之结合？

（2）四氢叶酸是一碳单位的载体，即四氢叶酸是一碳单位代谢的辅酶。一碳单位通常结合在FH4分子的N5、N10位。

（3）一碳单位还要来源于哪几种氨基酸代谢？

（3）一碳单位主要来源于丝，甘，组和色氨酸的代谢。 （4）简述一碳单位的生理功能

（4）一碳单位的生理功用：①作为合成嘌呤和嘧啶的原料：如：N10-CHO-FH4、N5N10-CH-FH4提供嘌呤环C2、C8的来源。N5N10-CH2-FH4提供胸苷酸的甲基来源。②把氨基酸代谢和核酸代谢联系起来。③药理作用：磺胺药通过干扰细菌、恶性肿瘤细胞的叶酸、四氢叶酸的合成，进一步影响一碳单位代谢与核酸合成。

6. 甲基化作用是体内重要的代谢反应，具有广泛的生理意义。哪种氨基酸可以提供甲基？其活性形式如何？又如何代谢转换，重新生成循环利用？ .答：（1）甲硫氨酸可以提高甲基分子中含有S-甲基，通过各种转甲基作用可以生成多种含甲基的重要生理活性物质。

（2）活性形式是S-腺苷甲硫氨酸，甲硫氨酸在转甲基之前，必须首先与ATP作用，生成S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。SAM中的甲基称为活性甲基，SAM称为活性甲硫氨酸。

（3）甲硫氨酸以SAM的形式供甲基后，S-腺苷同型半胱氨酸进一步转变成同型半胱氨酸，同型半胱氨酸可接受N5-CH3-FH4提供的甲基再重新形成甲硫氨酸，形成一个循环过程。 什么是核酸的核酸的变性、复性和杂交：

（一） 变性

在一定理化因素作用下，核酸双螺旋等空间结构中碱基之间的氢键断裂，变成单链的现象称为变性（denaturation）。引起核酸变性的常见理化因素有 加热、酸、碱、尿素和甲酰胺等。在变性过程中，核酸的空间构象被破坏，理化性质发生改变。由于双螺旋分子内部的碱基暴露，其A260值会大大增加。 A260值的增加与解链程度有一定比例关系，这种关系称为增色效应（hyperchromic effect）。如果缓慢加热DNA溶液，并在不同温度测定其A260值，可得到 “S”形DNA熔

化曲线（melting curve）。从DNA熔化曲线可见DNA变性作用是在一个相当窄的温度内完成的。

当A260值开始上升前DNA是双螺旋结构，在上升区域分子中的部分碱基对开始断裂，其数值随温度的升高而增加，在上部平坦的初始部分尚有少量碱基对使两 条链还结合在一起，这种状态一直维持到临界温度，此时DNA分子最后一个碱基对断开，两条互补链彻底分离。通常把加热变性时DNA溶液A260升高达到最 大值一半时的温度称为该DNA的熔解温度（melting temperature Tm），Tm是研究核酸变性很有用的参数。Tm一般在85～95℃之间，Tm值与DNA分子中G C含量成正比。

（二） 复性

变性DNA在适当条件下，可使两条分开的单链重新形成双螺旋DNA的过程称为复性（renaturation）。当热变性的DNA经缓慢冷却后复性称为退 火（annealing）。DNA复性是非常复杂的过程，影响DNA复性速度的因素很多：DNA浓度高，复性快；DNA分子大复性慢；高温会使DNA变 性，而温度过低可使误配对不能分离等等。最佳的复性温度为Tm减去25℃，一般在60℃左右。离子强度一般在0.4mol/L以上。

（三） 杂交

具有互补序列的不同来源的单链核酸分子，按碱基配对原则结合在一起称为杂交（hybridization）。杂交可发生在DNA-DNA、RNA-RNA 和DNA-RNA之间。杂交是分子生物学研究中常用的技术之一，利用它可以分析基因组织的结构，定位和基因表达等，常用的杂交方法有Southern印迹 法，Northern印迹法和原位杂交（insitu hybridization）等。

核酸的变性和复性变性(denaturation)和复性(renaturation) 是双链核酸分子的二个重要物理特性。也是核酸研究中经常引用的术语。双链DNA,RNA双链区,DNA: RNA杂种双链(hybrid duplex)以及其它异源双链核酸分子(heteroduplex) 都具有此性质。

蛋白质糖基化修饰主要有N-连接的糖基化和O-连接的糖基化两种类型。前者寡糖基直接连接的氨基酸残基是天冬酰胺（Asn），后者主要是丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr），此外也可能是羟脯氨酸和羟赖氨酸（如胶原蛋白）。 苏氨酸，丝氨酸、酪氨酸。因为他们有羟基基团，可以和磷酸基团脱水生成磷酸酯 lys，arg能被甲基化，

就是将氨基和乙酸酐进行反应，得到酰胺类物质，只要N上有H，基本上都可以进行乙酰化

氨基的烃基化：氨基酸与RX作用则烃基化而成N-烃基衍氨基酸

蛋白质检测方法汇总

(2010-11-17 19:06:09)

转载标签： 杂谈

▼

蛋白质检测方法汇总

化学测量 2008-11-10 17:42:19 阅读1281 评论1 字号：大中小订阅

蛋白质检测方法汇总

本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。 了解各种测定方法的基本原理和优缺点。

蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。 在选择方法时应考虑：

①实验对测定所要求的灵敏度和精确度； ②蛋白质的性质；

③溶液中存在的干扰物质； ④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法

样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： CH2COOH

| + 3H2SO4--------- 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) NH2

2NH3 + H2SO4 -------- ---(NH4)2SO4 (2)

(NH4)2SO4 + 2NaOH ----------- 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。

为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。

五种蛋白质测定方法比较如下：

方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法（Kjedahl法） 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ±2％ 费时 8～10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长

双缩脲法（Biuret法） 灵敏度低1～20mg 中速 20~30分钟 多肽键＋碱性Cu2＋?紫色络合物 硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似

紫外吸收法 较为灵敏50～100mg 快速 5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正 Folin－酚试剂法（Lowry法） 灵敏度高～5mg 慢速 40～60分钟 双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化

考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高1～5mg 快速5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS 最好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化

二、双缩脲法（Biuret法） （一）实验原理

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 H2O

O=C C=O HN NH R-CH CH-R O=C Cu C=O HN NH R-CH CH-R H2O

紫色络合物

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1. 试剂：

（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配

制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。

（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4²5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6²4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2. 器材：

可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 （三）操作方法

1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。

2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。 三、Folin—酚试剂法（Lowry法） （一）实验原理

这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：?在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。

进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。

此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。

（二）试剂与器材 1.试剂

（1）试剂甲：

（A） （A） 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6²4H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。

（B） （B） 0.5克硫酸铜（CuSO4²5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。 （2）试剂乙：

在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4²2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4²2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫 酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。 （3）标准蛋白质溶液:

精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。 2. 器材

（1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）秒表

（4）试管16支 （三）操作方法

1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。 注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。

进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。

Folin—酚试剂法实验表格：

管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6（约250mg/ml）蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 每管中蛋白质的量（mg）吸光度值（A700）

2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。

根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。

注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。

四、改良的简易Folin—酚试剂法 （一）试剂

1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。 2. 试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。 3. 标准蛋白质溶液：同基本法。 （二）操作步骤

测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。

改良的快速简易法，可获得与 Folin—酚试剂法（即Lowry基本法）相接近的结果。

五、考马斯亮兰法（Bradford法） （一）实验原理

双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 Bradford法的突出优点是：

（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在

1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。

（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 （二）试剂与器材 1. 试剂：

（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。 （2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。 2. 器材：

（1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）试管16支 （三）操作方法 1. 标准方法

（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。

（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

考马斯亮兰法实验表格：

管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 & nbsp; (1.0mg/ml) 未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml) 蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝 G－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋白质量（mg） 光吸收值 （A595）

（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。

0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。 2. 微量法

当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。 六、紫外吸收法

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。

此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。

此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。 下面介绍四种紫外吸收法： 1. 280nm的光吸收法

因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。

测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。

许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A1％1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。

蛋白质浓度 = (A280′10 )/ A1％1cm,280nm (mg/ml) (Q 1%浓度?10mg/ml)

例：牛血清清蛋白 ： A1％1cm=6.3 (280nm) 溶菌酶 ： A1％1cm=22.8 (280nm) 若查不到待测蛋白质的A1％1cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）。 标准曲线的测定：取6支试管，按下表编号并加入试剂： 管号 1 2 3 4 5 6

BSA（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0 A280

用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵座标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横座标作图，标准曲线应为直线，利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2至6管A280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A1％1cm,280nm 2. 280nm和260nm的吸收差法

核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：

纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 ? 1.8 纯核酸的光吸收比值： A280/A260 ? 0.5

含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。

蛋白质浓度=1.45³A280－0.74³A260 (mg/ml)

此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。 3. 215nm与225nm的吸收差法

蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。

用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差： 吸收差D= A215 －A225

以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。 本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。 4. 肽键测定法

蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50~500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值A238，以A238为纵座标, 蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。

进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。 本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。 考马斯亮兰法（Bradford法） （一）实验原理

双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 Bradford法的突出优点是：

（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。 （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 （二）试剂与器材 1. 试剂：

（1）标准蛋白质溶液，用g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。 （2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。 2. 器材：

（1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器

（3）试管16支 （三）操作方法 1. 标准方法

（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。

（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

考马斯亮兰法实验表格：

管 号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10标准蛋白质0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml)

未知蛋白质0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml)

蒸馏水0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝

G－250试剂5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0每管中的蛋 白质量（mg） 光吸收值 （A595）

（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。

0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。 2. 微量法

当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。 底物对酶促反应速度的影响:

底物浓度较低时,正比例关系影响(一级反应)

底物浓度提高,反应速度还在加快,无、幅度越来越小,混合级反应

最后底物浓度再高,反应速度也已经基本不变,说明全部酶分子都已经和底物结合,接近饱和状态(零级反应)

温度对酶促反应速度的影响

一方面升高温度可以增加活化分子数目,反应速度提高;

另一方面温度超过一定范围会导致酶蛋白变性失活,使酶促反应速度降低.酶促

反应速度最快时的反应温度称为该酶促反应的最适温度.

pH值对酶促反应速度的影响

反应体系的pH直接影响到酶和底物的解离状态,从而影响到酶与底物的结合,影响到酶促反应的速度.使酶促反应速度达到最快时的pH值称为酶促反应的最适pH值.

抑制剂对酶促反应速度的影响

能特异性的抑制酶活性,从而抑制酶促反应的物质称为抑制剂.

激活剂对酶促反应速度的影响

能使酶从无活性到有活性或使酶活性提高的物质称为酶的激活剂.

重要：1。DNA溶于苯酚而RNA不溶,故可用苯酚来沉淀 这是最简单的方法。

2。利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定，非固定细胞核酸，或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果，但该方法已被许多实验室广泛采用。

下面是生物化学的总结知识 1.两性解离：DNA无，只有酸解离（○P），碱基被屏蔽（在分子内部形成了H键）。 RNA有，有PI。

2.粘度大：DNA>RNA，粘度由分子长度/直径决定，DNA为线状分子，RNA为线团。 3.碱的作用：DNA耐碱

RNA易被碱水解。 4.显色反应：鉴别DNA和RNA

浓HCl 浓HCl RNA ------→ 绿色化合物 DNA ------→ 蓝紫色化合物

苔黑酚 二苯胺

啡啶溴红（荧光染料）和溴嘧啶都可对DNA染色，原理是卡在分子中，DNA的离心

和电泳显色可用它们。 5.溶解性：都溶于水而不溶于乙醇，因此，常用乙醇来沉淀溶液中的DNA和RNA。DNA溶于苯酚而RNA不溶，故可用苯酚来沉淀RNA。

6.紫外吸收：核酸的λm＝260nm，碱基展开程度越大，紫外吸收就越厉害。 当A＝1时，DNA：50ug/ml，RNA和单链DNA：40ug/ml，寡核苷酸：20ug/ml。 用A260/A280还可来表示核酸的纯度：>1.8，DNA很纯；>2RNA很纯。 7.沉降速度：对于拓扑异构体（核苷酸数目相同的核酸），其沉降速度为： RNA > 超螺旋DNA > 解链环状DNA > 松弛环状DNA > 线形DNA 也就是在离心管中最上层是线形DNA，最下面是RNA。

酶对所作用的底物有严格的选择性。一种酶仅能作用于一种物质，或一类分子结构相似的物质，促其进行一定的化学反应，产生一定的反应产物，这种选择性作用称为酶的专一性。

酶的专一性可分为三种类型：绝对专一性、相对专一性、立体专一性；也可分为：结构专一性和立体异构专一性。

1、核酸的基础研究：基因组克隆

2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序 3、反向PCR测定未知DNA区域

4、反转录PCR（RT-PCR）用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA

5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控 6、cDNA末端快速扩增技术 7、检测基因的表达

8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学。1、遗传病和某些疑难病的诊断以及孕妇的产前检查

2、病原体的检测。某些恶性疾病一般用微生物学、生化和免疫 学技术无法查出病原体时，可用PCR来检查。

3、法医和刑侦鉴定。PCR可灵敏检测出亲属间的亲缘关系，并对生物残留的痕量样品进行鉴定，因此，对刑侦极为有用。 4、癌基因的检查。 5、基因探针的制备。

6、基因组测序、染色体巡视。 7、cDNA库的构建。

8、基因突变的分析和定位诱变。 9、DNA重组。

10、基因的分享和克隆。

胰岛素能促进全身组织对葡萄糖的摄取和利用，并抑制糖原的分解和糖原异生，因此，胰岛素有降低血糖的作用。

胰岛素降血糖是多方面作用的结果： （１）促进肌肉、脂肪组织等处的靶细胞细胞膜载体将血液中的葡萄糖转运入细胞。 （２）通过共价修饰增强磷酸二酯酶活性、降低cAMP水平、升高cGMP浓度，从而使糖原合成酶活性增加、磷酸化酶活性降低，加速糖原合成、抑制糖原分解。 （３）通过激活丙酮酸脱氢酶磷酸酶而使丙酮酸脱氢酶激活，加速丙酮酸氧化为乙酰辅酶A，加快糖的有氧氧化。 （４）通过抑制PEP羧激酶的合成以及减少糖异生的原料，抑制糖异生。 （５）抑制脂肪组织内的激素敏感性脂肪酶，减缓脂肪动员，使组织利用葡萄糖增加。

概念： 糖类和脂肪、蛋白质等有机物质在细胞中进行氧化分解生成CO2和H2O并释放出能量的过程称为生物氧化（biological oxidation），换句话说，也就

是需氧细胞在呼吸代谢过程中所进行的一系列氧化还原反应过程。 特点：在活的细胞中（pH接近中性、体温条件下），有机物的氧化在一系列酶、辅酶和中间传递体参与下进行，其途径迂回曲折，有条不紊。 氧化过程中能量逐步释放，其中一部分由一些高能化合物（如ATP）截获，再供给机体所需。在此过程中既不会因氧化过程中能量骤然释放而伤害机体，又能使释放的能量尽可得到有效的利用。

2.底物水平磷酸化：是指物质在脱氢或脱水过程中，产生高能代谢物并直接将高能代谢物中能量转移到ADP(GDP)生成ATP(GTP)的过程。

3.3.氧化磷酸化：是指在生物氧化中伴随着ATP生成的作用。真核生物主要在线粒体中进行。

该学说假设能量转换和偶联机构具有以下特点：①由磷脂和蛋白多肽构成的膜对离子和质子具有选择性 ②具有氧化还原电位的电子传递体不匀称地嵌合在膜内 ③膜上有偶联电子传递的质子转移系统 ④膜上有转移质子的ATP酶。

1.酮体是乙酰乙酸、β羟基丁酸、丙酮的总称。： 酮体的生成：酮体主要在肝脏的线粒体中生成，其合成原料为乙酰CoA，关键酶是羟甲戊二酸单酰CoA合酶（HMG-CoA合酶）

其过程为：乙酰CoA→乙酰乙酰CoA →HMG-CoA→乙酰乙酸。生成的乙酰乙酸再通过加氢反应转变为β-羟丁酸或经自发脱羧生成丙酮。

2．酮体的利用：利用酮体的酶有两种，即琥珀酰CoA转硫酶（主要存在于心、肾、脑和骨骼肌细胞的线粒体中，不消耗ATP）和乙酰乙酸硫激酶（主要存在于心、肾、脑细胞线粒体中，需消耗2分子ATP）。

其氧化利用酮体的过程为：β-羟丁酸→乙酰乙酸→乙酰乙酰CoA→乙酰CoA→三羧酸循环。

3．酮体生成及利用的生理意义： ①正常情况下，酮体是肝脏输出能源的一种形式②在饥饿或糖供给不足情况下，为心、脑等重要器官提供必要的能源③酮体利用的增加可减少糖的利用，有利于维持血糖水平恒定，节省蛋白质的消耗

糖酵解：（1）葡萄糖(Glucose)磷酸化形成6－磷酸葡萄糖-G6P （2）6－磷酸果糖磷酸化形成1,6－磷酸果糖-FBP

（3）磷酸烯醇式丙酮酸将磷2\">转移给ADP形成ATP和丙酮酸 糖异生（1）丙酮酸→草酰乙酸→磷酸烯醇式丙酮酸, 丙酮酸 羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化

（2）1,6-二磷酸果糖→6-磷酸果糖，果糖二磷酸酶催化 |

（3）6-磷酸葡萄糖→葡萄糖，葡萄糖6磷酸酶催化

糖酵解、TCA循环、戊糖磷酸途径是葡萄糖等糖类物质彻底氧化的三个过程，糖异生与糖酵解相反是非糖类物质转化成葡萄糖，有三种酶与糖酵解不同，乙醛酸循环多在植物微生物中，和TCA循环过程不同，生理效果差不多。

糖酵解，TCA，电子传递链式呼吸糖氧化的3个阶段，戊糖磷酸途径是糖酵解的一种途径，乙醛酸循环是糖酵解的一个步骤

磷酸戊糖途径以葡萄糖-6-磷酸为起始物进入一个循环过程。该途径的第一阶段

涉及氧化性脱羧反应，生成5-磷酸核酮糖和NADPH。第二阶段是非氧化性的糖磷酸酯的相互转换。由于转酮醇酶和转醛醇酶催化反应的可逆性，使磷酸戊糖途径与糖酵解以及糖的异生作用发生了密切的联系，各途径中的中间物如果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸等可以根据细胞的需要进入到对方代谢途径中去

第一个是脂酸合成，第二个是贝他氧化。发生部位，细胞质，线粒体。酰基载体，ACP-SH.CoA-SH。2碳片段加入与裂解方式，丙二酰单酰CoA，乙酰CoA。电子供体或受体，NADPH.(FAD.NAD+)。酶系，复合体活多功能酶，四种酶。原料转运方式，柠檬酸转运系统，肉碱穿梭系统。羟脂酰化合物的中间构型，D型，L型。对二氧化碳和柠檬酸的需求，要求，不要求。能量变化，消耗七个ATP和十四NADPH，产生106个ATP

5、为什么说三羧酸循环是糖、脂、蛋白质三大物质代谢的共同通路？哪些化合物可以被认为是联系糖、脂、蛋白质和核酸代谢的重要环节？为什么？答案要点：①三羧酸循环是糖、脂、蛋白质三大物质代谢的共同氧化分解途径（2分）；三羧酸循环为糖、脂、蛋白质三大物质合成代谢提供原料（1分），要举例（2分）。②列举出糖、脂、蛋白质、核酸代谢相互转化的一些化合物（3分），糖、脂、蛋白质、核酸代谢相互转化相互转化途径（2分） ）。乙酰CoA可进入哪些代谢途径？请列出。（5分）糖的有氧氧化】葡萄糖→丙酮酸→乙酰辅酶A→CO2+H2O。 【糖的无氧氧化】葡萄糖→丙酮酸→乳酸。【糖的磷酸戊糖途径】葡萄糖→5-磷酸核糖、NADPH。【糖原合成】葡萄糖→肝糖原、肌糖原。【糖转化为脂肪】葡萄糖→乙酰辅酶A→脂肪酸→脂肪。 、何谓三羧酸循环？它有何特点和生物学意义？特点。1。乙酰CoA进入三羧酸循环后，是六碳三羧酸反应2。在整个循环中消耗2分子水，1分子用于合成柠檬酸，一份子用于延胡索酸的水和作用。3在此循环中，最初草酰乙酸因参加反应而消耗，但经过循环又重新生成。所以每循环一次，净结果为1个乙酰基通过两次脱羧而被消耗。循环中有机酸脱羧产生的二氧化碳，是机体中二氧化碳的主要来源。4在三羧酸循环中，共有4次脱氢反应，脱下的氢原子以NADH+H+和FADH2的形式进入呼吸链，最后传递给氧生成水，在此过程中释放的能量可以合成ATP。5三羧酸循环严格需要氧气6。琥珀CoA生成琥珀酸伴随着底物磷酸化水平生成一分子GTP，能量来自琥珀酰CoA的高能硫酯键意义。1三羧酸循环是机体将糖或者其他物质氧化而获得能量的最有效方式2，三羧酸循环是糖，脂和蛋白质3大类物质代谢和转化的枢纽。2、磷酸戊糖途径有何特点？其生物学意义何在？特点：无ATP生成，不是机体产能的方式。1）为核酸的生物合成提供5-磷酸核糖，肌组织内缺乏6-磷酸葡萄糖脱氢酶，磷酸核糖可经酵解途径的中间产物3- 磷酸甘油醛和6-磷酸果糖经基团转移反应生成。 2）提供NADPH a.NADPH是供氢体，参加各种生物合成反应，如从乙酰辅酶A合成脂酸、胆固醇；α-酮戊二酸与NADPH及氨生成谷氨酸，谷氨酸可与其他α-酮酸进行转氨基反应而生成相应的氨基酸。 b.NADPH是谷胱甘肽还原酶的辅酶，对维持细胞中还原型谷胱甘肽的正常含量进而保护巯基酶的活性及维持红细胞膜完整性很重要，并可保持血红蛋白铁于二价。 c.NADPH参与体内羟化反应，有些羟化反应与生物合成有关，如从胆固醇合成胆汁酸、类固醇激素等；有些羟化反应则与生物转化有关。物学意义1，

产生大量的NADPH，为细胞的各种合成反应提供还原力2，1 产生NADPH(注意：不是NADH！NADPH不参与呼吸链)2 生成磷酸核糖，为核酸代谢做物质准备 3 分解戊糖 意义：1 补充糖酵解2 氧化阶段产生NADPH，促进脂肪酸和固醇合成。 3 非氧化阶段产生大量中间产物为其它代谢提供原料3、糖酵解和发酵有何异同？糖酵解过程需要那些维生素或维生素衍生物参与？1. 相同点：(1)都要进行以下三个阶段：葡萄糖——>1,6-二磷酸果糖；1,6-二磷酸果糖——>3-磷酸甘油醛；3-磷酸甘油醛——>丙酮酸。(2)都在细胞质中进行。不同点：通常所说的糖酵解就是葡萄糖——>丙酮酸阶段。根据氢受体的不同可以把发酵分为两类：(1)丙酮酸接受来自3-磷酸甘油醛脱下的一对氢生成乳酸的过程称为乳酸发酵。（有时也将动物体内的这一过程称为酵解。）(2)丙酮酸脱羧后的产物乙醛接受来自3-磷酸甘油醛脱下的一对氢生成乙醇的过程称为酒精发酵。糖酵解过程需要的维生素或维生素衍生物有：NAD+。什么是乙醛酸循环？有何意义？在异柠檬酸裂解酶的催化下，异柠檬酸被直接分解为乙醛酸，乙醛酸又在乙酰辅酶A参与下，由苹果酸合成酶催化生成苹果酸，苹果酸再氧化脱氢生成草酰乙酸的过程。乙醛酸循环和三羧酸循环中存在着某些相同的酶类和中间产物。但是，它们是两条不同的代谢途径。乙醛酸循环是在乙醛酸体中进行的，是与脂肪转化为糖密切相关的反应过程。而三羧酸循环是在线粒体中完成的，是与糖的彻底氧化脱羧密切相关的反应过程。

油料植物种子发芽时把脂肪转化为碳水化合物是通过乙醛酸循环来实现的。这个过程依赖于线粒体、乙醛酸体及细胞质的协同作用。7、为什么糖酵解途径中产生的

+

NADH必须被氧化成NAD才能被循环利用？因为当3-磷酸甘油醛氧化为1,3-三磷酸甘油酸的时候反应中脱下的H必须为NAD+所接受才能生成NADPH和氢离子。8、试说明丙氨酸的成糖过程。（1）丙氨酸经GPT催化生成丙酮酸；（2）丙酮酸在线粒体内经丙酮酸羧化酶催化生成草酰乙酸，后者经苹果酸脱氢酶催化生成苹果酸出线粒体，在胞液中经苹果酸脱氢酶催化生成草酰乙酸，后者在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶作用下生成磷酸烯醇式丙酮酸；（3）磷酸烯醇式丙酮酸循糖酵解途径至1,6-双磷酸果糖；（4）1,6-双磷酸果糖经果糖双磷酸酶-1催化生成6-磷酸果糖，在异构为6-磷酸葡萄糖；（5）6-磷酸葡萄糖在葡萄糖-6-磷酸酶作用下生成葡萄糖9、试述无氧酵解、有氧氧化及磷酸戊糖旁路三条糖代谢途径之间的关系。1.在缺氧情况下进行的糖酵解。2.在氧供应充足时进行的有氧氧化。3.生成磷酸戊糖中间代谢物的磷酸戊糖途径。

5、在人的膳食中严重缺乏糖时（如进行禁食减肥的人群），为什么易发生酸中毒？酸中毒对人体有那些为害？怎样急救酸中毒病人？在病理情况下，当体内[BHCO3]减少或[H2CO3]增多时，均可使[BHCO3]/[H2CO3]比值减少，引起血液的pH值降低，称为酸中毒。体内血液和组织中酸性物质的堆积，其特点是血液中氢离子浓度上升、PH值下降。

糖代谢和脂类代谢：糖酵解产物还原成甘油，丙酮酸氧化脱羧形成乙酰辅酶A是脂肪酸合成原料，甘油和脂肪酸合成脂肪。脂肪又可分解成甘油和脂肪酸，沿不同途径转变成糖。糖代谢与蛋白质代谢：糖代谢分解产生的能量用于蛋白质合成。蛋白质降解产生的氨基酸经脱氨后生成产物可氧化放能，经糖异生生成糖。蛋白质代谢与脂类代谢：脂肪分解成甘油经进一步反应能产生谷氨酸族和天冬氨酸族氨基酸。在蛋白质氨基酸中，生糖氨基酸通过丙酮酸变甘油，也可氧化脱所成乙酰辅酶A，用于脂肪酸合成。生酮氨基酸可生成乙酰乙酸，所合

成脂肪酸。丝氨酸脱羧后形成胆氨，甲基化后变成胆碱，是合成磷脂的组成成分 第十二章 生物合成技术

1、解释盐析法沉淀蛋白质的基本原理？答：蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。而当蛋白质在等电点处时，蛋白质不带电，溶解度小，当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。

1.RT-PCRRT-PCR是将RNA模板的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。

5.cDNA文库以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA(cDNA)，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库(cDNA library)。与基因结DNA文库类似，由总mRNA制作的cDNA文库包含了细胞表达的各种mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的编码cDNA。当前发现的大多数蛋白质的编码基因几乎都是这么分离的。

8.SD序列原核生物中每一个mRNA都具有其核糖体结合位点，它是位于AUG上游8～13个核苷酸外的一个富含嘌呤(GGAGGU)的短片段，称SD序列。这段序列正好与30S小亚基中的16srRNA3′端一部分富含嘧啶的序列互补，因此SD序列也叫做核糖体结合序列，这种互补就意味着核糖体能选择mRNA上AUG的正确位置来起始肽链的合成。真核生物无此序列。

(1)Southern blotting：用同位素、生物素或荧光染料标记一小段已知序列的DNA，将其作为探针，与固定在膜上的DNA杂交，以检测膜上是否存在同源DNA分子。①基本操作：A性内切酶消化基因组DNA；B琼脂糖凝胶电泳；C变性；D将凝胶中的变性DNA区带转移到纤维素膜(NC膜)上；E封阻剂封闭非特异性位点；F加入探针杂交；G放射自显影、免疫反应或其他方法检测杂交区带。②应用：主要用于基因组DNA的分析，例如基因组中特异基因的定位和检测。

(2)Northern blotting：用同位素、生物素或荧光染料标记一小段已知序列的DNA或者RNA，将其作为探针，与固定在膜上的RNA杂交，以检测膜上是否存在同源RNA分子。基本操作类似Southern blotting，但是再转移前不需要进行酶切。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，及对不同组织细胞的表达水平进行比较。本方法检测mRNA的灵敏性没有RT-PCR好，但是专一性好，假阳性率低。 (3)Western blotting：蛋白质样品经SDS-PAGE电泳分离后，用电转移到固相支持物上(常用NC膜)，然后可进行染色。染色有直接法和间接法二种，常用间接免疫染色法。首先用抗靶蛋白的非标记特异性抗体与NC膜反应，经适当洗涤后，与抗原结合的抗体可以和用碱性磷酸酶、过氧化物酶或同位素标记的第二抗体反应，然后进行显色。用于检测样品中特异性蛋白质的存在、蛋白质半定量分析，以及蛋白质分子间相互作用的研究。Western blotting只能用电转移，而上两种方法可以用毛细法、电转移、真空吸引转移法。

原理

Western Blot与Southern印迹杂交或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 操作步骤

（一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。

（二）电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。 （三）转移：（半干式转移）

1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min³3次。

2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。 3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。 （四）免疫反应：

1、用0.01M PBS洗膜，5min ³3次。 2、加入包被液，平稳摇动，室温2hr。

3、弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5min³3次。 4、加入一抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃ 放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。 5、弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min³4次。

6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释），平稳摇动，室温2hr。

7、弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min³4次。

8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。 四、注意事项

1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。

2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。 3、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。

基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA 技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞 中，并使之无性繁殖（称之为\"克隆\"）和行使正常功能（称之为\"表达\"），从而 创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般说来，基因工程是专指用生物化学 的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天 然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA 结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中 复制，继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克 隆。然后直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达 体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。

常用的工具酶

有多种方法可获得目得基因 1.构建cDNA文库分离目的基因 过程：

（1）从真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下合成cDNA的 第一条链。

（2）以第一条链为模板，以反转录酶或DNA聚合酶Ｉ作用下合成cDNA的第二条

链。

（3）在甲基化酶作用下使cDNA甲基化。 （4）接头或衔接子连接。 （5）凝胶过滤分离cDNA。

（6）通过核酸探针法或免疫反应法从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。 2.人工化学合成法

适于已知的核苷酸序列且校小的ＤＮＡ片断合成，常用方法有磷酸二酯法、 磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法等。

过程：先用以上方法合成基因DNA不同部位的两条链的寡核苷短片段，再退火成 为两端形成粘性末端的DNA双链片段。然后将这些DNA片段按正确的次序进行退 火连接起来形较长的ＤＮＡ片段，再用连接酶连接成完整的基因。 3.利用PCR技术直接扩增目的基因 PCR PCRPCR

PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术， 已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需 的双引物，类似于DNA的天然复制过程，用ＰＣＲ法进行扩增，特异地合成目的 cDNA链，用于重组、克隆。 1.载体的选择（以质粒为例） ⑴载体必须是复制子。

⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在宿主细胞内稳定性高。

(6)应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别

(7)应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。

(8)应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而 不转录其他无关的基因，且所产生的mRNA较为稳定。 (9)所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。

2.制备有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌 体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。 在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA

却不会被变性。通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构， 而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上 清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。 构建基因表达载体

1.用一定的酶切割质粒，使其出现一个切口，露出粘性末端。 2.用同一种酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。

3.将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一 个重组DNA分子（重组质粒）。 目的基因导入受体细胞

1.将目的基因导入植物细胞－农杆菌转化法 2.将目的基因导入动物细胞－显微注射法

3.将目的基因导入微生物细胞（以大肠杆菌为例）

（1）用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周 围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.

（2）将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下 促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.

（3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快， 在很短的时间内就能获得大量的目的基因。 检测与鉴定

1.要检测目的基因是否插入转基因生物染色体的DNA上 检测方法：采用DNA分子杂交技术 2.检测目的基因是否转录了mRNA

检测方法：同样用分子杂交技术DNA与RNA杂交 3.检测目的基因是否翻译成蛋白质

检测方法：提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带，表明 目的基因已形成蛋白质产品。

基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

乙酰辅酶A携带2个C进入三羧酸循环，期间经过两次脱羧，第一次(草酰琥珀酸到α-酮戊二酸)脱去的C来自乙酰辅酶A，但第二次(α-酮戊二酸到琥珀酰-CoA)脱去的C并不是来自于乙酰辅酶A，而是来自最初的草酰乙酸，因此循环之后形成的新的草酰乙酸带有一个14C，这个草酰乙酸进入葡糖异生路径生成葡萄糖，再合成糖原。

1、简述转录的基本过程.

①起始，RNA聚合酶全酶与DNA启动子结合，首先由ζ因子识别DNA启动子的识别部位，核心酶则结合在启动子的结合部位，DNA双螺旋局部打开，暴露DNA模板链，RNA的合成原料NTP按照碱基互补原则定位进入模板链，在RNA聚合酶的催化下，第一个和第二个NTP之间形成3 ′，5′-磷酸二酯键，同时释放一个焦磷酸，当第一个磷酸二酯键形成后，ζ因子脱落，起 始阶段结束。 ②延长、RNA聚合酶核心酶沿DNA模板链3′→5′滑动，每往前移动一个核苷酸距离，就有一个与模板互补的NTP进入反应体系，在RNA聚合酶的催化下，逐一地形成3′，5′-磷酸二酯键，使新合成的RNA分子不断延长。

③终止，DNA分子上具有终止转录的终止信号，此部位有一段富含GC区，并有反向重复序列，使转录生成的RNA形成发夹结构，此发夹结构可阻碍RNA聚合酶

的移动，从而终止转录。此外还有一种蛋白质称ρ因子，它对RNA聚合酶识别终止信号有辅助作用，故称终止因子。

、简述各种RNA的加工过程. mRNA前体的加工，包括剪接，去除内含子，拼接外显子；5′端加帽m7Gppp;3′端加polyA尾巴；碱基修饰。

tRNA前体的加工包括剪接，去除多余的核苷酸；3′端加CCA-OH；碱基的修饰形成烯有碱基。

rRNA前体的加工，主要是剪接和碱基修饰

1、简述RNA的分类,各类RNA的结构特点及其在蛋白质生物合成中的作用 ①mRNA，5′端有帽子结构m7Gppp;3′端有polyA;依次相连的三个核苷酸组成一个密码，共有个密码

，其中61个密码代表20种氨基酸，1个起始密码，3个终止密码。mRNA在蛋白 质合成中起直接模板的作用。

②tRNA，其二级结构为三叶草形。有氨基酸臂；DHU环；反密码环，TφC环；额外环。tRNA 能选择性的转运活化了的氨基酸到核蛋白体上，参与蛋白质的生物合成。 ③rRNA,rRNA和多种蛋白质组成核蛋白体，核蛋白体由大、小亚基组成，是蛋白质生物合成 的场所。

2、2、从原料,模板,合成方向和合成方式的基本特点几个方面来比较DNA的合 成,RNA的合成和蛋白质合成.

 DNA合成 RNA合成 蛋白质合成 原料 dNTP NTP 20种氨基酸 模板 DNA DNA的模板链 mRNA

合成方向 5′→3′ 5′→3′ N→C

合成方式半保留复制 不对称转录 核蛋白体循环

3、简述在蛋白质生物合成中每延长一个氨基酸要经过哪些步骤? ①进位，与受位上mRNA嘧码对应的氨基酰-tRNA进入。 ②转肽；核蛋白体大亚基上的转肽酶将给位上的肽酰(蛋氨酰)基转移到受位氨基酰-tRNA的 α氨基上，形成肽键。

③移位：空载的tRNA从核蛋白体上脱落，核蛋白体沿mRNA向3′端移动一个密码子距离，肽 酰-tRNA随之移到了给位，受位空下来。又可进行下一个循环，进位，转肽，移位。

2、胰高血糖素升高血糖的生化机理如何?

胰高血糖素与靶细胞膜受体结合成复合物通过G蛋白介导，活化腺苷酸环化酶，使ATP分解或cAMP,后者可激活蛋白激酶A，使糖原磷酸化酶磷酸化，使酶活性增高，促肝糖原分解，同时使糖原合成酶磷酸化降低其活性，抑制糖原合成，总结果是使血糖升高。

7、何谓操纵子? 以大肠杆菌乳糖操纵子为例说明原核生物操纵子的机制。

1）操纵子定义:是原核生物转录的基本单位，由一组结构基因及上游的序列组成。

2）阻遏蛋白的负性调节：

（1）无乳糖存在时，阻遏物可以结合在操纵基因上 → 阻止转录过程 → 基因关闭；

（2）有乳糖存在时，乳糖→半乳糖与阻遏物结合→阻遏物变构 → 阻遏物不能结合操纵基因 → 转录进行 → 基因开放。 3）CAP的正性调节

（1）CAP：分解（代谢）物基因激活蛋白结合在启动子上游的CAP位点上 （2）CAP + cAMP→复合物→结合在CAP的结合位点上→促进RNA pol向前移动 →促转录

（3）当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用；

（4）如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。 4）协调调节：培养基中葡萄糖和乳糖共同存在时，细菌先利用葡萄糖。

1、试述肝脏在糖代谢,脂代谢及蛋白质代谢中的作用 .

肝脏在糖代谢中的作用是多方面的，但最重要的作用是维持血糖的相对稳定，保证全身 各组织(特别是脑组织)糖的供应。此作用主要是通过肝糖原的合成与分解，以及糖异生等过 程来实现的。

肝脏在脂类的消化，吸收，分解，合成及运输等代谢过程中有着重要的作用。肝细胞能分泌 胆汁酸盐，它具有强的乳化作用，可促进脂类的消化与吸收。肝细胞含有促进脂肪酸β氧化的酶类及脂肪酸合成的酶类，因此肝脏是脂肪酸氧化，脂肪酸合成的主要器官，肝细胞还 是合成酮体，磷脂，胆固醇的重要场所。80%以上的胆固醇是在肝脏变成胆汁酸盐。

肝脏在蛋白质合成、分解代谢中均有重要作用，肝脏可合成大部分血浆蛋白。包括全部 清蛋白，纤维蛋白原，凝血因子等，以及部分球蛋白。肝细胞富含有关氨基酸代谢的酶，如转氨酶，脱氨酶，转甲基酶，脱羧酶等，肝脏是体内氨基酸分解，转变的场所，肝脏又是解 氨毒的主要器官。

5、胆固醇与胆汁酸之间的代谢关系是什么？ ①胆汁酸是由胆固醇在肝细胞内分解生成；

②胆汁酸的合成受肠道向肝内胆固醇转运量的调节，胆固醇在抑制HMG－CoA还原酶， 从而降低体内胆固醇合成的同时，增加胆固醇7a一羟化酶基因的表达，从而使胆汁酸的合成量亦增多。

③胆固醇的消化吸收排泄均受胆汁酸盐的影响

1、简述DNA复制的过程.

①在拓扑异物酶和解链酶的作用下，DNA双螺旋结构打开，形成局部单链，DNA结合蛋白与单链DNA结合，使单链DNA不致复性。

②引物酶辨认复制起始点，并利用四种NTP为原料，以单链DNA为模板，按5′→3′方向合成 RNA引物片段。

③在RNA引物的3′-OH端，DNA聚合酶Ⅲ以单链DNA为模板催化四种dNTP，合成5′→3′方向 的DNA。

④在DNA聚合酶Ⅰ的作用下，水解切除RNA引物，并由该酶催化DNA片段继续延长，填补空缺 。⑤由DNA连接酶将相邻的两个DNA片段连接起来，形成完整的DNA链。 2、 试述DNA复制的基本规律。

a.半保留复制：复制时，母链的双链DNA解开成两股单链，各自作为模板指导子代合成新的互补链。子代细胞的DNA双链，其中一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。由于碱基互补，两个子细胞的DNA双链，都和亲代母链DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。

b.双向复制：复制时，DNA从起始点向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制原核生物是单个起始点的双向复制，真核生物是多个起始点的双向复制。 c.半不连续性复制： DNA双螺旋的两条链是反平行的，而DNA合成的方向只能是5’→3’ 。在DNA复制时，1条链的合成方向和复制叉的前进方向相同，可以连续复制，叫作领头链；而另一条链的合成方向和复制叉的前进方向正好相反，不能连续复制，只能分成几个片段（冈崎片段）合成，称之为随从链。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。

3、何谓反转录作用?它在医学上有何意义?

以RNA为模板，以4种dNTP为原料，在RNA指导的DNA聚合酶的催化下，按照碱基互补的原则合成DNA的过程。

逆转录酶存在于所有的致癌RNA病毒中，其功能可能和病毒的恶性转化有关。病毒的RNA通过逆转录先形成DNA(前病毒)，然后整合到宿主细胞染色体DNA中去，使病毒的遗传信息在宿主细胞中得到表达，即宿主细胞除合成自身蛋白质以外，又能合成病毒特异的某些蛋白质，而后者又和癌症的发生关系密切。

4、叙述参与DNA复制的酶类有哪些以及它们各自的功能.

①DNA指导的DNA聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶包括DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其中DNA聚合酶 Ⅰ在DNA的损伤修复中起主要作用，DNA聚合酶Ⅲ在DNA复制中起主要作用。 ②解链，解旋酶类，包括解链酶，拓扑异构酶，单链DNA结合蛋白，它们的共同作用是解开 ，理顺DNA双链。维持DNA处于单链状态。 ③引物酶，其本质为DNA指导的RNA聚合酶，它可以DNA为模板，合成短链RNA，以提供3′-OH 末端为DNA聚合酶延长DNA链作准备。

④DNA连接酶，连接DNA链3′-OH末端和另一DNA链的5′-P末端，形成磷酸二酯键，从而把两 段相邻的DNA链连接成完整的链。 

2、叙述大肠杆菌RNA聚合酶的组成以及它们各自的功能.

大肠杆菌RNA聚合酶全酶由α2ββ′ζ五部分组成，其中α亚基决定哪些基因被转录，β与转录全过程有关，β′亚基结合DNA模板，ζ亚基辨认DNA转录的起始部位与DNA启动子的识别部位结合。

6

、试叙述油料作物种子萌发时脂肪转化为糖的原理？

油料种子萌发时，脂肪先水解为脂肪酸和甘油，再进一步转化为糖类，才供能利用。脂肪 转化为糖的过程基本是氧化过程，在转化的各个阶段要不断的吸收氧化，其水解作用需借助 脂酶的活动。脂肪水解为脂肪酸和甘油后，前者大部分可部分氧化，形成乙酰辅酶 A

进入三羧酸循环，最终彻底氧化成二氧化碳和水，释放能量，另外一种甘油分子可以形成丙酮酸，

它有可能形成葡萄糖。

直接修复：不需要切除，直接将核苷酸逆转为正常的，包括嘧啶二聚体修复，烷基化碱基修复和DNA链断裂的修复。

切除修复：切除损伤的碱基和核苷酸，按照另一条互补链重新合成正常的核苷酸，再由连接酶重新连接。包括BER和NER

双链断裂修复：比较严重了，因为没有互补的模板链了，只能依靠两种方式修复，一是同源重组，精确性比较高，一种是非同源末端连接，就是通过蛋白帮助直接连接在一起，精确性低 损伤跨越：非常严重的损伤已经祸及复制的正常进行，一种是依靠重组跨越损伤，一种是随机插入核苷酸（无论对错）先跨过损伤复制再说

1.在专一的酶促作用下，5‘端形成特殊的帽子结构

2.在RNA末端腺苷酸转移酶的作用下，在3’端添加polA尾巴。 3.通过特殊的机制，去掉内含子，将外显子连接起来 4.对链内特定的核苷酸进行甲基化修饰。

1、转录后的RNA不能直接用于翻译蛋白，要去掉内含子（真核动物），才能翻译出正确的蛋白。

2、RNA在细胞核内完成转录，但需要到细胞质中翻译成为蛋白， 经过加工的RNA既可以进入细胞质并且不会被细胞质内的酶讲解掉（RNA是非常不稳定的生物大分子，因为RNA酶是广泛存在的，不论体内还是体外）。

3、一部分RNA是要有二级结构的，转录后的加工可以使RNA形成正确的二级结构。

4、RNA经过加工后，会被加上帽子和尾巴结构，这些其实是核糖体识别的“标签”，这样更容易被识别、翻译。

类型：mRNA、tRNA和rRNA；hnRNA、snRNA、miRNA、iRNA等。

相同点：都是通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成的单链多聚核糖核酸。 不同点

mRNA：携带从DNA编码链得到的遗传信息，并以三联体读码方式指导蛋白质生物合成的长链RNA，由编码区、上游的5′非编码区和下游的3′非编码区组成。约占细胞RNA总量的3%～5%。真核生物mRNA的5′端带有7-甲基鸟苷-5′-三磷酸的帽子结构和3′端含多腺苷酸的尾巴。

tRNA：通过单链自身回折成三叶草形状，它由3个环，即D环〔因该处二氢尿苷酸（D）含量高〕、反密码环（该环中部为反密码子）和TΨC环〔因绝大多数tRNA在该处含胸苷酸（T）、假尿苷酸（Ψ）、胞苷酸（C）顺序〕，四个茎，即D茎（与D环联接的茎）、反密码茎（与反密码环联接）、TΨC茎（与 TΨC环联接）和氨基酸接受茎〔也叫CCA茎，因所有tRNA的分子末端均含胞苷酸（C）、胞苷酸（C）、腺苷酸（A）顺序， CCA是连接氨基酸所不可缺少的〕，以及位于反密码茎与TΨC茎之间的可变臂构成。三级结构呈“L”状。

rRNA：rRNA的分子量较大，结构相当复杂，目前虽已测出不少rRNA分子的一级结构，但对其二级、三级结构及其功能的研究还需进一步的深入。rRNA与核糖体蛋白结合成核糖体。真核生物核糖体中通常含28S、18S、5.8S和5S 四种rRNA；原核生物中则含23S、16S和5S 三种rRNA

蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化

合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。是生物体内重要的共价修饰方式之一,其磷酸化和去磷酸化这一可逆过程,受蛋白激酶和磷酸酶的协同作用控制.

酪氨酸磷酸化和多蛋白复合体的形成构成了细胞信号转导的基本机制，几乎所有的多肽细胞生长因子都是通过此途径来激活细胞，刺激细胞生长,酪氨酸磷酸化除了在变构以及激活该蛋白的活力之外，更重要的功能是结核蛋白提供一个结构基因，以促进其和其他蛋白质相互作用而形成多蛋白复合体。蛋白复合体的形成再进一步促进蛋白质的磷酸化。周而复始，由最初蛋白质磷酸化所产生的信号就一步步如此转下去。如果最初产生的是一个刺激细胞生长的信号，此信号便最终转入细胞核，导致DNA复制和细胞。

中心法则(genetic central dogma)是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质的转录和翻译的过程，以及遗传信息从DNA传递给DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒中的RNA自我复制（如烟草花叶病毒等）和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程（某些致癌病毒）是对中心法则的补充。

示遗传信息传递规律的中心法则(Central Dogma),是现代生物学中最基本、最重要的规律之一,该法则的产生有其深刻的科学思想和科学社会基础.自其产生以后,随着研究的深入,内容和形式都得到了丰富和修正,显示出其核心思想不是简单的单向决定作用,而是复杂的相互作用,确立这一核心思想有助于预测其未来的发展.中心法则在探讨生命现象的规律方面显示出巨大的作用,极大地推动了生物科学的发展,是现代生物学的理论基石,并为生物学基础理论的统一指明了方向,在生命科学史上占有重要的地位.

①目的不同，所使用的酶、原料及其它辅助因子不同，转录是合成RNA，复制是合成DNA；②方式不同：转录是不对称的，只在双链DNA的一条链上进行，只以DNA的一条链为模板，复制为半不连续的，分别以DNA的两条链为模板，在DNA的两条链上进行；③复制需要引物，转录不需要引物；④复制过程存在校正机制，转录过程则没有；⑤转录产物需要加工，复制产物不需要加工；⑥复制与转录都经历起始、延长、终止阶段，都以DNA为模板，新链按碱基互补原则，5'→3’方向合成。 不同点：

复制 转录

①模板不同： 两股链均复制 模板链转录（不对称转录） ②原料不同： dNTP NTP

③酶不同： DNA聚合酶 RNA聚合酶（RNA-pol） ④产物不同： 子代双链DNA（半保留复制） mRNA,tRNA,rRNA

⑤配对不同： A-T , G-C A-U , T-A , G-C

1.真核生物有多个复制起始位点，而原核只有一个起始位点。

2.真核生物复制一旦启动，在完成本次复制前，不能在再启动新的复制，而原核复制起始位点可以连续开始新的复制，特别是快速繁殖的细胞。

3.真核生物和原核生物的复制不同。

4.原核的DNA聚合酶III复制时形成二聚体复合物，而真核的聚合酶保持分离状态。

5.真核生物的聚合酶没有5'-3'外切酶活性，需要一种叫FEN1的蛋白切除5'端引物，原核的DNA聚合酶I具有5'-3'外切酶活性。 2.染色体端体的复制不同。原核生物的染色体大多数为环状，而真核生物染色体为线状。末端有特殊DNA序列组成的结构成为端体。

3.3 真核生物DNA的合成所需的RNA引物及后随链上合成的冈崎片段的长度比原核生物要短。

4原核生物中有DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种聚合酶，并有DNA聚合酶Ⅲ同时控制两条链的合成。真核生物中有α、β、γ、ε、δ五种聚合酶。聚合酶α、δ是DNA 合成的主要酶，分别控制不连续的后随链以及前导链的生成。聚合酶β可能与DNA修复有关，聚合酶γ则是线粒体中发现的唯一一种DNA聚合酶

（1）原核生物mRNA以多顺反子的形式存在，真核生物mRNA一般以单顺反子形式存在。

（2）原核生物mRNA的转录与翻译一般是偶联的，真核生物转录的mRNA前体需经过转录后加工，加工为成熟的mRNA与蛋白质结合生成信息体后才开始翻译。 （3）原核生物mRNA半衰期短，一般为几分钟，最长只有数小时。真核生物mRNA的半衰期较长。

（4）原核与真核生物mRNA的结构特点也不同。

（2）真核生物RNA聚合酶较多，在原核生物中只有一种RNA聚合酶。 （3）真核生物的转录在细胞核内进行，原核生物则在拟核区进行。

酶活力可以反映酶的纯化得率。

比活力可以反映酶的纯化纯度，也可以看出酶是否变性失活。

酶活力是酶催化反应的能力，用酶活单位表示；在酶的纯化过程中常表示酶的回收率。比活力是单位质量的酶制剂所具有的酶活单位数，在纯化过程中，它所反映的是酶制剂的纯度。

2、比活力(性)(Specific Activity)是酶纯度的量度,即指:单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数,一般用IU/mg蛋白质来表示.一 般来说,酶的比活力越高,酶越纯.。

常人血糖的来源主要有3条途径。①饭后食物中的糖消化成葡萄糖，吸收入血循环，为血糖的主要来源。②空腹时血糖来自肝脏，肝脏储有肝糖元，空腹时肝糖元分解成葡萄糖进入血液。③蛋白质、脂肪及从肌肉生成的乳酸可通过糖异生过程变成葡萄糖。

正常人血糖的去路主要有5条。①血糖的主要去路是在全身各组织细胞中氧化分解成二氧化碳和水，同时释放出大量能量，供人体利用消耗。②进入肝脏变成肝糖元储存起来。③进入肌肉细胞变成肌糖元贮存起来。④转变为脂肪储存起来。⑤转化为细胞的组成部分。 (二)血糖水平的调节

机体血糖水平维持稳定主要靠激素的调节，重要的激素有胰岛素、胰高血糖素、糖皮质激素和肾上腺素，若糖代谢及调节障碍，可发生糖尿病或低血糖。尤其糖尿病

是危害人类健康的重要疾病，患者葡萄糖得不到有效利用，可导致机体发生一系列代谢紊乱，造成各种严重的病理状态。 1?胰岛素

胰岛素是体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。血糖升高时，立即引起胰岛素分泌。其降血糖是多方面作用的结果： ①促进葡萄糖转运入细胞，降低血液中糖含量。

②通过共价修饰使糖原合成酶活性增加，磷酸化酶活性降低，加速糖原合成，抑制糖原分解。

③激活丙酮酸脱氢酶，加快糖的有氧氧化

④通过抑制PEP羧激酶的合成以及减少糖异生的原料，抑制糖异生。 ⑤抑制脂肪组织内的脂肪酶，减少脂肪动员，使组织利用葡萄糖增加。

2?胰高血糖素是体内主要升高血糖的激素。其升血糖的机制几乎与胰岛素相反：

①抑制糖原合成酶，激活磷酸化酶使糖原分解增加，糖原合成降低。 ②减少2，6-双磷酸果糖的合成，抑制糖酵解，加速糖异生。 ③促进PEP羧激酶的合成，抑制丙酮酸激酶，增强糖异生。 ④通过激活脂肪酶，加速脂肪动员，从而间接升血糖。 3?肾上腺素：

肾上腺素是迅速而强有力升高血糖的激素，主要在应激时起作用，对经常性，尤其是进食引起的血糖波动无生理意义。主要是通过加快糖原分解，促进糖异生升高血糖。

4?肾上腺皮质醇：

是肾上腺皮质分泌的类固醇激素，主要是糖皮质激素，它能促进肌肉蛋白质分解，增强糖异生，同时抑制肝外组织摄取葡萄糖，从而升高血糖。

支原体这种微小的微生物（直径0.2-0.8 µm），是细胞培养中令人头疼的大问题。支原体污染可能来自培养基、血清或实验操作者，会影响细胞生长率、细胞形态、基因表达、细胞代谢和细胞活力。支原体感染不易察觉，因此对培养细胞定期进行支原体检测就非常重要。 分离培养法是支原体检测的金标方法，其检测精确度最高。这种方法是从可疑的细胞培养体系中取样，并接种到最适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体，它们就会在这种琼脂平板上疯狂生长，最终形成明显可见的特征性菌落。分离培养法基本不会出现假阴性结果，因此被誉为支原体检测金标准。 DNA检测生物通 www.ebiotrade.com

DNA检测需要将可疑样品与指示细胞共同培养，因此一般需要几天时间。DNA检测所用的指示细胞通常是细胞质区域较大的Vero细胞，如果原样本中含有支原体，那么当细胞DNA被荧光染料（如Hoechst染料）染色时，就可以在指示细胞的核周围观察到荧光斑点或荧光颗粒。分离培养法用来检测支原体M. hyorhinis菌株并不可靠，而DNA法可以准确的将其检测出来。生物通 PCR法生物通

PCR法也可以检测M. hyorhinis菌株，PCR法检测支原体只需几个小时，是最快但也是最不灵敏的支原体检测方法。该方法采用针对支原体DNA的引物用PCR检测可疑样本，其中PCR引物通常针对支原体的16S rRNA基因。在凝胶电泳过程中，支原体DNA会显示为特异性条带，以此指示支原体的存在。PCR法可以检测大多数支原体，但谨慎起见最好同时

使用另一种检测方法来进行验证。 酶学检测和ELISA

此外，也还存在一些其他支原体检测方法。例如酶学检测是将可疑样本添加到特定底物中，在这一体系内支原体的酶可以将ADP转化为ATP，随后能利用ATP发光的luciferase酶就可以指示支原体的存在。ELISA也能用于支原体检测，以ELISA法为基础的支原体检测一般使用针对支原体16S rRNA基因的带标记探针或抗体，来检测培养物中是否含有支原体。

:(1)预防为主:细胞培养实验室应制定严格的管理制度,按照规范的实验程序操作。(2)从可靠来 源引进、使用细胞,特别是知名的信誉,良好的专门机构,如ATCC、基础医学细胞中心等,这些机构对细胞质量进行一系列检测。(3)定期对实验室中的培养 物进行支原体检测。一旦发现已经污染支原体的培养物,要避免支原体的进一步播散,如细胞株易获得,灭活后弃之,更换新的培养物;如细胞株珍贵,有效方法救 治后检测确无支原体污染后继续使用。

细胞质是进行新陈代谢的主要场所，绝大多数的化学反应都在细胞质中进行。同时它对细胞核也有作用。骨架蛋白与细胞形态和运动密切相关，被认为对胞质溶胶中酶反

应提供了有利的框架结构。绝大部分物质中间代谢（如醣酵解作用、氨基酸、脂肪酸和核苷酸代谢）和一些蛋白的修饰作用（如磷酸化）在胞质溶胶中进行。悬浮在胞质溶胶中的细胞器，有具界膜的和无界膜的，它们参与了细胞的多种代谢途径。内含物则是在细胞生命代谢过程中形成的产物，如糖原、色素粒、脂肪滴等。

线粒体前体蛋白信号序列的特点是：①多位于肽链的N端，由大约20个氨基酸构成；②没有带负电荷的氨基酸，形成一个两性α螺旋，带正电荷的氨基酸残基和不带电荷的疏水氨基酸残基分别位于螺旋的两侧，现在认为这个螺旋与转位因子的识别有关；③对所牵引的蛋白质没有特异性要求，非线粒体蛋白连接上此类信号序列，也会被转运到线粒体。进入线粒体内膜和膜间隙的蛋白具有以下几种情况（图7-30）：①蛋白N端具有两个信序列，首先被运送到基质，然后N端信号肽被切除，暴露出导向内膜的信号序列，在OXA的帮助下插入内膜。如果第二段信号序列被内膜外表面的异二聚体内膜蛋白酶（heterodimeric inner membrane peptidase，Imp1/imp2）切除，则成为膜间隙蛋白。②N端信号序列的后面有一段疏水序列，扮演停止转移序列的角色，能与TIM23复合体结合，当进入基质的信号序列被切除后，脱离转位因子复合体而进入内膜，如果插入膜中的部分又被酶切除，侧成为定位于膜间隙的蛋白。③线粒体内膜上负责代谢底物／产物转运的蛋白，如腺苷转位酶是多次跨膜蛋白，其N端没有可被切除的信号序列，但包含3－6个内部信号序列，可被TIM22复合体插到内膜上。

进入内膜和膜间隙的前体蛋白具有两个信号序列，经TOM／TIM23进入基质后，第二个信号序列使蛋白通过OXA复合体被安插到内膜上；B. 进入内膜和膜间隙的前体蛋白信号序列后具有停止转移序列，被TIM23安插在膜上，C. 通过途径A、B插入内膜的蛋白，被位于内膜的蛋白酶加工，成为膜间隙的可溶性蛋白，D. 线粒体代谢物的转运器为多次跨膜蛋白，被TIM22安插到内膜中）

蛋白质的输入是一个耗能的过程，能量的来源为水解ATP和利用质子动力势．能量消耗在线粒体外和进入线粒体基质两步上，在线粒体外解除与前体蛋白质结合的分子伴娘，需要通过水解ATP获得能量；在通过TIM复合体进入基质时利用质子动力势作为动力。虽然目前含不清楚质子动力势是如何被利用的，但解偶连接

如DNP能抑制蛋白质的转运。前体蛋白进入线粒体基质后，线粒体hsp70一个接一个的结合在蛋白质线性分子上，像齿轮一样将蛋白质“铰进（hand over hand）”基质，这一过程也需要消耗ATP。然后线粒体hsp70将蛋白质交给hsp60，完成折叠。

叶绿体蛋白的转运机理与线粒体的相似。如：通常前体蛋白N端具有信号序列，完成转运后被信号肽酶切除，和线粒体一样发生后转译；每一种膜上有特定的转位因子；内外膜具有接触点（contact site）；需要能量，同样利用ATP和质子动力势。但是两者的蛋白质转运体系中除了某些hsp分子相同外，转位因子复合体是不同的。叶绿体外膜的转位因子被称为TOC复合体，内膜的转位因子被称为TIC复合体。

叶绿体有6个区隔：①外膜、②膜间隙、③内膜、④基质、⑤类囊体膜、⑥类囊体腔。因此叶绿体的蛋白转运途径更复杂一些。

叶绿体前体蛋白的N端信号序列长度为20－150 个氨基酸残基，同一植物不同前体蛋白的N端序列不具有同源性，分为3 个部分：N 端缺乏带正电荷的氨基酸，以及甘氨酸和脯氨酸；C 端形成两性β折叠；中间富含羟基化的氨基酸，如丝氨酸和苏氨酸。

转运到叶基质的前体蛋白具有典型的N端序列。转运到叶绿体内膜和类囊体的前体蛋白含有两个N端信号序列，第一个被切除后，暴露出第二个信号序列，将蛋白导向内膜或类囊体膜（图7-30）。转运到叶绿体外膜上的蛋白分两类：一类含内部信号序列；另一类蛋白的N 端序列被切除后，其后的停止转移序列使蛋白质定位在外膜。

与微管和微丝相比, 中间纤维在结构和功能上至少有三方面的差异。

● 首先, 中间纤维是相当稳定的结构,即使用含有去垢剂和高盐溶液抽提细胞, 中间纤维仍然保持完整无缺。

● 第二, 中间纤维在体积上与微管和微丝是不同的, 微管的直径是24nm, 微丝的直径是7nm, 而中间纤维则是10nm。而且形态上也不相同, 微管是由αβ微管蛋白二聚体组装成的中空管状, 微丝是由球形亚基装配成的α螺旋纤维, 而中间纤维的亚基是α-螺旋杆状装配成似杆状的结构。

● 第三,中间纤维的亚基并不与核苷酸结合, 而微管的亚基与GTP或GDP结合。 微丝的亚基则与ATP或ADP结合,但是对于中间纤维装配的许多细节尚不清楚。

微丝除参与形成肌原纤维外还具有以下功能：

1．形成应力纤维（stress fiber）：非肌细胞中的应力纤维与肌原纤维有很多类似之处：都包含myosin II、原肌球蛋白、filamin和α-actinin。培养的成纤维细胞中具有丰富的应力纤维，并通过粘着斑固定在基质上。在体内应力纤维使细胞具有抗剪切力 2．形成微绒毛

3．细胞的变形运动：分为四步：

①：微丝纤维生长，使细胞表面突出，形成片足(lamellipodium)。 ②在片足与基质接触的位置形成粘着斑。

③在myosin的作用下微丝纤维滑动，使细胞主体前移。

④解除细胞后方的粘和点。如此不断循环，细胞向前移动。阿米巴原虫、白细胞、成纤维细胞都能以这种方式运动。

4．胞质：有丝末期，两个即将分离的子细胞内产生收缩环，收缩环由平行排列的微丝和myosin II组成。随着收缩环的收缩，两个子细胞的胞质分离，在细胞松弛素存在的情况下，不能形成胞质环，因此形成双核细胞。 5．顶体反应：在精卵结合时，微丝使顶体突出穿入卵子的胶质里，融合后受精卵细胞表面积增大，形成微绒毛，微丝参与形成微绒毛，有利于吸收营养。 6．其他功能：如细胞器运动、质膜的流动性、胞质环流均与微丝的活动有关，抑制微丝的药物（细胞松弛素）可增强膜的流动、破坏胞质环流。

微管在细胞内的作用大致可分为四个方面，首先是起支架作用，为细胞维持一定的形态提供结构上的保证，并给各种细胞器进行定位； 维持细胞形态是微管的基本功能。实验证明,微管具有一定的强度，能够抗压和抗

弯曲，这种特性给细胞提供了机械支持力 第二是作为细胞内物质运输的轨道；

微管在核的周围分布密集, 并向胞质外周伸展, 在线粒体周围也有微管的存在, 有的微管直接连到高尔基体小泡上, 核糖体可系在微管及微丝的交叉点上。所以, 细胞内的细胞器移动和胞质内物质转运都和微管有着密切的关系。 第三是作为纤毛和鞭毛运动元件； 第四是参与细胞的有丝和减数

细胞核是细胞的控制中心，控制遗传和代谢 细胞质是新陈代谢的主要场所

结构：主要是由核膜、染色质、核仁和核骨架构成。

功能：控制细胞的遗传，生和长和发育

细胞核是细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。一般说真核细胞失去细胞核后，很快就会死亡，但红细胞失去核后还能生活120天；植物筛管细胞，失去核后，能活好几年。

1．遗传物质储存和复制的场所。从细胞核的结构可以看出，细胞核中最重要的结构是染色质，染色质的组成成分是蛋白质分子和DNA分子，而DNA分子又是主要遗传物质。当遗传物质向后代传递时，必须在核中进行复制。所以，细胞核是遗传物储存和复制的场所。

2．细胞遗传性和细胞代谢活动的控制中心。遗传物质能经复制后传给子代，同时遗传物质还必须将其控制的生物性状特征表现出来，这些遗传物质绝大部分都存在于细胞核中。所以，细胞核又是细胞遗传性和细胞代谢活动的控制中心。例如，英国的克隆绵羊“多莉”就是将一只母羊卵细胞的细胞核除去，然后，在这个去核的卵细胞中，移植进另一个母羊乳腺细胞的细胞核，最后由这个卵细胞发育

而成的。“多莉”的遗传性状与提供细胞核的母羊一样。这一实例充分说明了细胞核在控制细胞的遗传性和细胞代谢活动方面的重要作用。所以细胞核控制细胞质，细胞核周围围绕着细胞质

单个核糖体上存在四个活性部位,在蛋白质合成中各有专一的识别作用。 1.A部位:氨基酸部位或受位:主要在大亚基上,是接受氨酰基-tRNA的部位。 2.P部位:肽基部位或供位:主要在小亚基上,是释放tRNA的部位。

3.肽基转移酶部位(肽合成酶),简称T因子:位于大亚基上,催化氨基酸间形成肽键,使肽链延长。

4.GTP酶部位:即转位酶（EF-G）,简称G因子,对GTP具有活性,催化肽键从供体部位→受体部位。 另外,核糖体上还有许多与起始因子、延长因子、释放因子以及各种酶相结合的位点

主要分为三步， 参与的因子包括起始因子1-3，以及mRNA、转运tRNA、GTP等。①30S亚基与mRNA的结合 mRNA不能与完整的核糖体结合，但是能够同存在的30S核糖体小亚基结合。在原核生物中，30S核糖体小亚基通过16S rRNA与mRNA起始密码子AUG上游的SD序列的互补，从而与mRNA结合。核糖体小亚基与mRNA的结合还需要起始因子(initiation factor. IF)的帮助，原核生物的起始因子命名为IFs，真核生物的起始因子命名为eIFs。原核生物有三种起始因子，其中有两种(IF1、IF3)通过与30S核糖体亚基的结合帮助30S亚基与mRNA的识别与结合。② 第一个aa-tRNA进入核糖体 当mRNA与核糖体小亚基结合后，携带甲酰甲硫氨酸的tRNA通过反密码子与mRNA中AUG的识别从而进入核糖体。起始tRNA在与mRNA形成mRNA-30S亚基复合物之前，必须同GTP、起始因子IF2结合，形成GTP-IF2-tRNAfMet复合物。起始tRNA复合物与mRNA的AUG密码子结合后，释放IF3。③ 完整起始复合物的装配 一旦起始tRNA与AUG密码子结合，核糖体大亚基就加入到复合物中形成完整的核糖体-mRNA起始复合物。该过程伴随GTP的水解、IF1和IF2的释放。其中GTP的水解可能引起核糖体构型的变化，而改变了的构型正是蛋白质合成所必需的。

9. 细胞中Ca2+浓度通常不到10-7M，这是如何控制的?（答案）

答: 控制的方式是多方面的, 包括:①在正常情况下,膜对Ca2+是高度不通透的。②质膜和ER的膜中含有能够将Ca2+从胞质溶胶中泵出细胞外或泵进ER腔的运输系统。许多不同的刺激,如神经冲动到达肌细胞,都会触发靶细胞通过打开质膜或ER膜中Ca2+通道进行应答。③Ca2+通过膜通道扩散,使胞质溶胶中Ca2+浓度快速升高。

细胞质膜中的钙离子泵将胞质溶胶中的Ca2+运输到细胞外，而内质网膜中钙离子泵则将Ca2+隐藏到内质网腔。除了钙泵以外，某些细胞的质膜中还有Na+-Ca2+交换泵，将Na+输入到细胞质，而将Ca2+从胞质溶胶中输出; 此外，线粒体膜也能将钙离子运输到线粒体基质。细胞通过上述的钙离子运输体系将细胞质中的Ca2+维持在极低的水平。提高细胞质中钙离子浓度主要是通过各种刺激作用打开细胞质膜和内质网膜中的钙离子通道。

在内质网膜上有两种主要类型的Ca2+通道，其中一种是IP3受体，另一种是RyRs(ryanodine receptor)受体，这种受体与植物碱结合而打开。Ryanodine受体主要是在刺激型细胞中发现的，在这些细胞中， 当达到动作电位时，ryanodine受体开放，使细胞质中Ca2+升高。在不同类型的细胞中，使ryanodine受体打开的介质也有所不同，Ca2+本身也可以将Ca2+通道打开。当有限量的Ca2+通过质膜进入细胞质时，可以诱导SER膜中的ryanodine受体打开，使内质网中的Ca2+释放到胞质溶胶中，这种现象称为钙诱导的钙释放(calcium-induced calcium release

5. 真核细胞中核糖体的合成和装配过程如何?（答案）

答: 整个过程相当复杂， 首先要合成与核糖体装配有关的蛋白质，这些蛋白质包括核糖体结构蛋白和与前体rRNA加工有关的酶。它们都是在细胞质的游离核糖体上合成， 然后迅速集中到细胞核并在核仁区参与核糖体亚基的装配。 而组成核糖体亚基的18S rRNA、5.8 SrRNA和28S rRNA基因则是在核仁中边转录边参与核糖体亚基的装配， 5S rRNA却是在细胞核中转录后运送到核仁中参与核糖体亚基的装配。

装配过程中，45S RNA、5S RNA同蛋白质形成80S RNA颗粒，然后80S 颗粒被降解成大小两个颗粒，大颗粒为55S，含有32S 和5S两种RNA，小颗粒含有20S的前体rRNA。然后，小颗粒中的20S RNA前体被快速降解成 18S 的rRNA，并运送到细胞质中，即是成熟的核糖体小亚基。55S大颗粒中的32S RNA被加工形成28S和 5.8S 两种rRNA成为成熟的大亚基后，被运送到细胞质中，这个过程比较慢。如果这时有mRNA同小亚基结合的话，大亚基即可结合上去形成完整的核糖体，并进行蛋白质的合成。

8. 请详细说明多肽链延伸的过程。（答案）

答: 蛋白质合成的肽链延伸涉及四个重复的步骤∶①氨酰tRNA进入核糖体的A位点；②肽键形成；③转位;④脱氨酰tRNA释放。上述四步的循环，使肽链不断延长。在整个过程中，需要GTP和一些延长因子的参与。

①氨酰-tRNA进入A位 由于起始tRNA占据P位点，核糖体开始接受第二个氨酰-tRNA进入A位点，此即为延伸的第一步。第二个氨酰-tRNA在进入A位点之前，必须与结合有GTP的蛋白延伸因子结合(原核细胞中延伸因子是Tu，真核生物则是eEF1)。Tu起传递作用，即将氨酰-tRNA传递给核糖体。虽然任何氨酰-tRNA-Tu-GTP都有可能进入A位，但只有反密码子与A位点密码子相匹配的tRNA才允许进入A位。一旦合适的氨酰-tRNA-Tu-GTP同A位点的密码子结合，GTP水解，Tu-GDP被释放。

②肽键形成 当核糖体的P位和A位都有tRNA占据时，进入核糖体的两个氨基酸是分开的，所以延伸反应的第二步是两个氨基酸相互作用，通过肽键的形成将两个氨基酸结合起来。即由A位的aa-tRNA 上氨基酸的氨基与P位aa-tRNA 上氨基酸的羧基间形成肽键， 使P位的tRNA卸去氨基酸，而A位上的tRNA形成了二肽。肽键的形成是自动发生的，不需要额外的能量。这一反应是由肽酰转移酶(peptidyl transferase)催化的，该酶是核糖体大亚基的组成成份。多年来一直认为肽酰转移酶是组成50S亚基的一种蛋白，现在已经清楚，它是构成核糖体的

RNA，是核酶。

③转位(translocation) 当形成了第一个肽键时，A位点上的tRNA分子的一端仍然与mRNA的密码子结合，而另一端与肽结合.此时P位点上的tRNA没有氨基酸的结合。接下来进入延伸反应的第三步:转位，即核糖体沿着mRNA从5＇→3＇方向移动三个核苷酸(一个密码子)，在此过程中，A位的tRNA-二肽移到P位，而P位的tRNA则进入E位点。转位需要另一个GTP结合的延伸因子的参与(原核生物是延伸因子G，真核生物是延伸因子eEF2)。GTP水解释放的能量转变成机械能，将核糖体沿着mRNA移动大约1 nm。

④脱氨酰tRNA的释放 延伸反应的最后一步是脱氨酰tRNA离开核糖体的E位点。一旦肽酰tRNA转位到P位，A位点再次开放，接受下一个aa-tRNA。在这种情况下，进入的氨酰-tRNA的反密码子必须与第三个密码子互补， 开始下一个循环。 在蛋白质合成的延伸反应中，每一次循环至少水解两分子的GTP， 耗时二十分之一秒，速度之快是惊人的。

3. 请说明内膜系统的形成对于细胞的生命活动具有哪些重要的意义?（答案） 答: 至少有六方面的意义:

① 首先是内膜系统中各细胞器膜结构的合成和装配是统一进行的，这不仅提高了合成的效率，更重要的是保证了膜结构的一致性，特别是保证了膜蛋白在这些膜结构中方向的一致性。

② 内膜系统在细胞内形成了一些特定的功能区域和微环境，如酶系统的隔离与衔接, 细胞内不同区域形成pH值差异, 离子浓度的维持, 扩散屏障和膜电位的建立等等，以便在蛋白质、脂类、糖类的合成代谢、加工修饰、浓缩过程中完成其特定的功能。

③ 内膜系统通过小泡分泌的方式完成膜的流动和特定功能蛋白的定向运输，这不仅保证了内膜系统中各细胞器的膜结构的更新，更重要的是保证了一些具有杀伤性的酶类在运输过程中的安全，并能准确迅速到达作用部位。

④ 细胞内的许多酶反应是在膜上进行的,内膜系统的形成,使这些酶反应互不干扰。

⑤ 扩大了表面积,提高了表面积与体积的比值。

⑥ 区室的形成,相对提高了重要分子的浓度,提高了反应效率

17. 减数的生物学意义何在？（答案） 答: 减数的生物学意义主要在两个方面：

①减数保证了有性生殖生物在世代交替中染色体数目的恒定

有性生殖是生物在长期进化历程中较无性生殖更为进步的一种繁殖方式。雌雄配子的融合, 把不同遗传背景的父母双方的遗传物质混在一起, 其结果既稳定了遗传,又添加了诸多新的遗传变异, 大大增强生物对千变万化环境的适应能力。然而, 如果没有一种机制使精卵细胞染色体数减少一半, 那么精卵细胞的融合, 将使染色体数倍增下去, 细胞的体积也就不断地膨胀, 细胞将不能适应环境而遭淘汰。减数保证了生殖细胞在细胞周期中染色体的单倍化，然后通过受精作用还原为二倍体。,没有减数，有性生殖将是不可能的。 ②减数是遗传重组的原动力，增加了生物多样性

减数也是遗传变异产生的主要原因。在生物进化过程中，如果没有遗传变异的话，生物就不能适应环境的变化，就会失去长期生存的能力。在减数过程

中，有两种方式发生遗传重组。一种是通过亲代染色体在单倍体细胞中的自由组合，产生的配子所含的染色体在组成上既有祖父的也有祖母的。第二种方式是同源染色体配对时发生的DNA交换。这种遗传重组过程产生的单个染色体中既有父本的也有母本的基因。减数就是通过这样两种机制产生遗传上独特的四个单倍体细胞，每个细胞都含有新重组的遗传信息。

18. 细胞周期是指连续的细胞从上一次有丝结束到下一次有丝完成所经历的整个过程。分为间期和期两个阶段。

间期又可分为G1期、S期、G2期。

G1期即DNA合成前期，从有丝到DNA复制前的一段时期，此期主要合成RNA和核糖体；

S期即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白，DNA复制所需要的酶 都在这一时期合成；

G2期即DNA合成后期，是有丝的准备期，在这一时期，大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等；

期又称M期，可分为前期、中期、后期、末期。

前期：染色质丝高度螺旋化，逐渐形成染色体；染色体短而粗，强嗜碱性。两个中心体向相反方向移动，在细胞中形成两极；而后以中心粒随体为起始点开始合成微管，形成纺锤体；核仁逐渐消失；核膜逐渐瓦解；

中期：核仁与核被膜已完全消失；染色体均移到细胞的赤道平面，从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点上；染色体呈短粗棒状或发夹状，均由两个染色单体借狭窄的着丝点连接构成；

后期：由于纺锤体的活动，着丝点纵裂，每一染色体的两个染色单体分开，并向相反方向移动，接近各自的中心体，染色单体遂分为两组；与此同时，细胞被拉长，并由于赤道部细胞膜下方环行微丝束的活动，该部缩窄，细胞遂呈哑铃形； 末期：染色单体逐渐解螺旋，重新出现染色质丝与核仁；内质网囊泡组合为核被膜；细胞赤道部缩窄加深，最后完全为两个2倍体的子细胞 。

（一）DNA水平的

DNA水平上的是通过改变基因组中有关基因的数量、结构顺序和活性而控制基因的表达。这一类的机制包括基因的扩增、重排或化学修饰。其中有些改变是可逆的。

（二）转录水平的 定某个基因是否会被转录，什么时候转录，并决定转录的频率。

（三）转录后

在真核生物中，蛋白质基因的转录产物统称为核不均一RNA，必须经过加工才能成为成熟的mRNA分子。，加工过程包括三个方面：加帽、加尾和去掉内含子。决定初始的RNA转录产物（hn RNA）如何剪接和加工为成熟的mRNA。 （四）翻译水平的

在真核生物中，基因表达的主要发生在转录水平上，但是，翻译水平的也是十分重要的。

阻遏蛋白与mRNA结合，可以阻止蛋白质的翻译。 转录后的内含子剪切过程在

基因表达的中具有重要意义。成熟的mRNA可以失活状态贮存起来。 决定某种mRNA是否会真正得到翻译，如果能得到翻译，还决定翻译的频率和时间长短。

（五）翻译后

从mRNA翻译成蛋白质，并不意味着基因表达的就结束了。直接来自核糖体的线状多肽链是没有功能的，必须经过加工才具有活性。在蛋白质翻译后的加工过程中，还有一系列的机制在蛋白被翻译后，选择性激活蛋白或使蛋白失活。

端粒是真核生物线性染色体末端重要的DNA-蛋白质复合结构，由TTAGGG重复序列和大量的端粒结合蛋白组成。主要是由六个端粒结合蛋白TRF1、TRF2、POT1TIN2、

TPP1和Rap1组成的复合体起着保护端粒的作用，被称为是遮蔽蛋白。其中端粒重复序列结合因子TRF1和TRF2是两个主要的端粒结合蛋白，它们通过相互作用来维持端粒的正常结构和功能。 端粒的功能：1、保护染色体末端：真核生物的端粒DNA-蛋白复合物，如帽子一般，保护染色体末端免于被化学修饰或被核酶降解，同时可能还有防止端粒酶对端粒进行进一步延伸的作用。改变端粒酶的模板序列将导致端粒的改变，从而诱导细胞衰老和死亡。

2、防止染色体复制时末端丢失：细胞、染色体进行半保留复制时，存在染色体末端丢失的问题。随着细胞的不断，DNA丢失过多，将导致染色体断端彼此发生融合，形成双中心染色体、环状染色体或其他不稳定形式。端粒的存在可以起到缓冲保护的作用，从而防止染色体在复制过程中发生丢失或形成不稳定结构。

3、决定细胞的寿命：染色体复制的上述特点决定了细胞的次数是有限的，端粒的长度决定了细胞的寿命，故而被称为“生命的时钟”。

4、固定染色体位置：染色体的末端位于细胞核边缘，人类端粒DNA和核基质中的蛋白相互作用，以′TTAGGG′结构附着于细胞核基质。

端粒酶的结构及功能：端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，由端粒逆转录酶(hTERT)、端粒酶RNA组分(hTR)以及端粒酶相关蛋白组成。端粒酶利用其自身hTR所携带的RNA为模板，在hTERT的逆转录催化下，将端粒重复序列合成到染色体末端，延长或稳定了随着细胞而进行性缩短的端粒，在细胞永生化及恶性肿瘤的发生和发展中起到了重要的作用。

总之，端粒酶是一种特殊的反转录酶，是一种能延长端粒末端并保持端粒长度的核糖蛋白酶，由RNA和蛋白质亚单位组成，每个RNA均含有一段短的与端粒互补的序列，能以自身RNA模板合成端粒DNA添加到染色体末端，避免染色体复制丢失端粒DNA以使端粒延长从而延长细胞寿命。

分化的细胞虽然保留了全套的遗传信息，但只有某些基因得到表达，即细胞分化主要是组织特异性基因中某些种(或某些)特定基因的选择性表达的结果，这些蛋白和分化细胞的特异性状密切相关，但不是细胞基本生命活动必不可少的。研究证明，细胞分化是奢侈基因按一定顺序表达的结果，表达的基因数约占基因总数

的5％～10％。也就是说，某些特定奢侈基因表达的结果生成一种类型的分化细胞，另一组奢侈基因表达的结果导致出现另一类型的分化细胞。另外，分化细胞间的差异往往是一群基因表达的差异，而不仅仅是一个基因表达的差异。在基因的差异表达中，包括结构基因和调节基因的差异表达，差异表达的结构基因受组织特异性表达的基因的调节。