[19]中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[21]申请号200410074753.3
[51]Int.CI7
C12N 9/74
[43]公开日2005年3月2日[22]申请日2004.09.15[21]申请号200410074753.3
[71]申请人黄耀江
地址100176北京市经济技术开发区中和街5号[72]发明人王永成 黄耀江 裴靖 荆强
[11]公开号CN 1587401A
权利要求书 2 页 说明书 4 页
[54]发明名称
一种制备凝血酶的方法
[57]摘要
本发明提供了一种从动物血液以及人血液中提取凝血酶的方法。该方法是利用层析介质从血浆中吸附凝血酶原，对层析柱进行洗脱，活化凝血酶原，得凝血酶溶液，经超滤浓缩，最后冻干得凝血酶成品。该方法在常温常压下进行，工艺环保，生产周期短，凝血酶提取效率高，一般每升血浆能提取5万IU以上的凝血酶产品；操作简单，本发明仅需离心、上样层析、超滤和冻干等几个步骤，容易实现工业化生产。
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权 利 要 求 书
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1、一种制备凝血酶的方法，该方法包括以下几个步骤： (1)、向血液中加入抗凝剂，离心分离，取上清抗凝血浆； (2)、将收集所得的上清抗凝血浆上阴离子层析柱层析，用洗脱剂对层析柱进行洗脱，洗脱液即为凝血酶原溶液；
(3)、如洗脱剂中使用了柠檬酸三钠，在进行活化之前对凝血酶原溶液进行超滤脱盐；
(4)、在常温常压下活化凝血酶原，得凝血酶溶液；
(5)、将凝血酶溶液进行超滤浓缩，得凝血酶浓缩液； (6)、将凝血酶浓缩液冻干，即得白色的粉状凝血酶成品。 2、根据权利要求1所述的制备凝血酶的方法，其特征在于：所述的血液是猪血、牛血等动物血液或人血液。
3、根据权利要求1所述的制备凝血酶的方法，其特征在于：所述抗凝剂是柠檬酸三钠或者草酸钾。
4、根据权利要求3所述制备凝血酶的方法，其特征在于：使用柠檬酸三钠抗凝剂，浓度为0.109mol/L的柠檬酸三钠溶液与血液的体积比为1∶7-1∶9。
5、根据权利要求3所述的制备凝血酶的方法，其特征在于：使用草酸钾抗凝剂，浓度为0.125mol/L的草酸钾溶液与血液的体积比为1∶7-1∶9。 6、根据权利要求1所述的制备凝血酶的方法，其特征在于：所述的洗脱剂是pH值为6-9的氨基酸或者柠檬酸三钠溶液。
7、根据权利要求6所述的制备凝血酶的方法，其特征在于：氨基酸或者
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柠檬酸三钠溶液的浓度是0.01-0.3mol/L。
8、根据权利要求1所述的制备凝血酶的方法，其特征在于：所述的洗脱剂是调节pH值为6-9，以氨基酸为保护剂，以柠檬酸三钠溶液为缓冲液，以氯化钠或者其它无机盐为离子增强剂组成的混合溶液。
9、根据权利要求1所述的制备凝血酶的方法，其特征在于：所述的活化凝血酶原，是使用CaCl2为活化剂，直接向凝血酶原溶液中加入CaCl2溶液，在常温常压下活化1-3小时得凝血酶溶液。
10、根据权利要求9所述的制备凝血酶的方法，其特征在于：加入CaCl2溶液后的凝血酶原溶液中所含Ca
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的终浓度为0.05-0.15mol/L。
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说 明 书
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一种制备凝血酶的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是以动物血液为原料制备凝血酶的方法。 技术背景
目前国内外主要从动物血浆及人血浆中制备凝血酶原，再经激活物激活而成为凝血酶。它可催化血纤维蛋白原中血纤维肽A和B的断裂，转变成不溶性血纤维蛋白凝块。凝血酶在临床上应用广泛，常以干粉或溶液局部涂于伤口及手术处，控制毛细血管血液渗出，多用于骨出血、扁桃腺摘除和拔牙时出血等。有时也可口服，用于胃和十二指肠出血。凝血酶局部止血效果好，且无副作用。目前凝血酶的应用范围正日渐扩大，由单纯的局部外敷发展到外科手术、耳鼻喉、口腔、妇产、泌尿及消化道等部位出血的止血，亦可作为多种外用止血药物的重要原料，其止血效果优于“对氨基苯甲酸”、“止血环酸”、“止血敏”等通过注射后须经血管收缩而起止血作用的药物。 凝血酶是一种蛋白质，其制备方法一般包括三个基本步骤，即提取、纯化和冻干(或制剂)。我国专利ZL92112188、ZL93110426和ZL96103650分别提出了从猪血或者牛血中提取凝血酶的方法，但这些方法都存在着工艺流程复杂、生产周期长和收率低等问题。 发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种工艺流程简单、生产周期短和收率高的制备凝血酶的方法。
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本发明制备凝血酶的方法包括以下几个步骤：
(1)、向血液中加入抗凝剂，离心分离，取上清抗凝血浆； (2)、将收集所得的上清抗凝血浆上阴离子层析柱层析，用洗脱剂对层析柱进行洗脱，洗脱液即为凝血酶原溶液；
(3)、如洗脱剂中使用了柠檬酸三钠，在进行活化之前对凝血酶原溶液进行超滤脱盐；
(4)、在常温常压下活化凝血酶原，得凝血酶溶液； (5)、将凝血酶溶液进行超滤浓缩，得凝血酶浓缩液；
(6)、将凝血酶浓缩液冻干，即得白色的粉状凝血酶成品。 本发明制备凝血酶的方法中，所述的血液是猪血、牛血等动物血液或人血液。
所述抗凝剂可以是柠檬酸三钠溶液或者草酸钾溶液。使用柠檬酸三钠抗凝剂，浓度为0.109mol/L的柠檬酸三钠溶液与血液的体积比为1∶7-1∶9。使用草酸钾抗凝剂，浓度为0.125mol/L的草酸钾溶液与血液的体积比为1∶7-1∶9。
所述的洗脱剂可以是pH值为6-9的氨基酸或者柠檬酸三钠溶液。氨基酸或者柠檬酸三钠溶液的浓度是0.01-0.3mol/L。所述的洗脱剂也可以是调节pH值为6-9，以氨基酸为保护剂，以柠檬酸三钠溶液为缓冲液，以氯化钠或者其它无机盐为离子增强剂组成的混合溶液。
所述的活化凝血酶原，是使用CaCl2为活化剂，直接向凝血酶原溶液中加入CaCl2溶液，在常温常压下活化1-3小时得凝血酶溶液。加入CaCl2溶液后的凝血酶原溶液中所含Ca的终浓度为0.05-0.15mol/L。 本发明具有如下优点：
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1、本发明提供的凝血酶提取纯化方法在常温常压下进行； 2、凝血酶提取效率高。一般每升血浆能提取5万IU以上的凝血酶产品； 3、操作简单，易实现自动化控制。工艺仅需5～6个步骤，包括：离心、上样层析、超滤脱盐、活化、超滤浓缩和冻干等几个步骤，这些过程均易实现自动化控制；
4、本发明环保。工艺彻底摒弃了以往的有机溶剂提纯方法，操作过程中对人员和周围环境不产生危害，工艺末段采取了适当的废物处理措施，废物排放符合国家的环保要求；
5、工艺周期短，整个工艺生产仅需3天(包括冻干)左右。 具体实施方式
实施例1 采集羊血液2800ml，加入0.109mol/L的柠檬酸三钠抗凝剂400ml，离心分离。取上清抗凝血浆1000ml。将上述血浆上已平衡好的阴离子层析柱，用调节pH为8，浓度为0.2mol/L的氨基酸洗脱剂对层析柱进行洗脱，得凝血酶原的洗脱液883.2ml，加入1mol/L的CaCl2溶液76.8ml，使得凝血酶原溶液中Ca的终浓度为0.08mol/L，常温常压下活化凝血酶原3小时，得凝血酶溶液960ml，标记为A1。采用超滤机对凝血酶溶液进行浓缩，浓缩约5倍左右，得凝血酶浓液190ml。冻干上述凝血酶浓液，即得白色的粉状凝血酶成品。
实施例2采集猪血液4300ml，加入0.109mol/L的柠檬酸三钠抗凝剂500ml，离心分离。取上清抗凝血浆1000ml。将上述血浆上已平衡好的阴离子层析柱，用调节pH为7，浓度为0.1mol/L的柠檬酸三钠洗脱剂对层析柱进行洗脱，得凝血酶原的洗脱液1590ml。对洗脱液进行超滤脱盐，得到凝血酶原溶液1832.1ml。加入1mol/L的CaCl2溶液137.9ml，使得凝血酶原溶液中Ca
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的终浓度为0.07mol/L，常温常压下活化凝血酶原3小时，得凝血酶溶液1970ml，标记为A2。采用超滤机对凝血酶溶液进行浓缩，浓缩约9倍左右，得凝血酶浓液200ml。冻干上述凝血酶浓液，即得白色的粉状凝血酶成品。 实施例3采集牛血液3200ml，加入0.125mol/L的草酸钾溶液抗凝剂400ml，离心分离。取上清抗凝血浆1500ml。将上述血浆上已平衡好的阴离子层析柱，采用以柠檬酸三钠为缓冲液，以氨基酸为保护剂，以氯化钠为离子增强剂等所组成的洗脱剂，调节pH为7，对层析柱进行洗脱，得凝血酶原的洗脱液1146ml。对洗脱液进行超滤脱盐，得到凝血酶原溶液1440ml。加入1mol/L的CaCl2溶液160ml，使得凝血酶原溶液中Ca的终浓度为0.1mol/L，常温常压下活化凝血酶原3小时，得凝血酶溶液1600ml，标记为A3。采用超滤机对凝血酶溶液进行浓缩，浓缩约8倍，得凝血酶浓液200ml。冻干上述凝血酶浓液，即得白色的粉状凝血酶成品。
实施例4 按照《中华人民共和国药典》2000版二部第1056～1057页的有关凝血酶效价标准检测方法，作标准曲线，对上述凝血酶产品A1、A2和A3进行效价检测，采用紫外260nm/280nm检测法进行蛋白浓度检测，检测结果如表1所示。根据凝血酶效价检测结果以及相应的蛋白浓度检测结果，计算凝血酶比活和得率(IU/L血浆)，其结果如下表所示。 凝血酶质量检测及分析结果
凝血酶效价
类 别
(IU/ml)
凝血酶A1凝血酶A2凝血酶A3
52.578.273.8
(mg/ml)0.150.120.10
(IU/mg蛋白)350.0651.7732.8
(IU/L血浆)50400154000118080
蛋白浓度
凝血酶比活
得 率
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