用于稳定凝血酶活性的化合物和方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105683371 A (43)申请公布日 2016.06.15

(21)申请号 2014800595.4(22)申请日 2014.10.21(30)优先权数据

229134 2013.10.29 IL61/6674 2013.10.29 US(85)PCT国际申请进入国家阶段日 2016.04.29

(86)PCT国际申请的申请数据

PCT/IL2014/000056 2014.10.21(87)PCT国际申请的公布数据

WO2015/063753 EN 2015.05.07(71)申请人奥姆里克斯生物药品有限公司

地址以色列雷霍沃特(72)发明人N.奥尔 Y.皮伊佩 S.多龙(74)专利代理机构中国专利代理()有限公

司 72001

代理人黄登高 彭昶(51)Int.Cl.

C12N 9/74(2006.01)C12Q 1/37(2006.01)A61K 38/48(2006.01)A61P 7/04(2006.01)

C12N 9/96(2006.01)C12N 15/57(2006.01)

(54)发明名称

用于稳定凝血酶活性的化合物和方法(57)摘要

本发明涉及可用于稳定凝血酶活性的化合物，包含所述化合物的凝血酶组合物，使用所述化合物的方法以及鉴定能够稳定凝血酶活性的化合物的方法。所述化合物优选是分离的肽，所述肽包含凝血酶的γ环或与其相互作用。

权利要求书2页 说明书20页

序列表4页 附图7页

C N 1 0 5 6 8 3 3 7 1 ACN 105683371 A

权　利　要　求　书

1/2页

1.一种能够在液体凝血酶制剂中稳定凝血酶活性的化合物，其中所述化合物选自分离的肽，所述分离的肽包含所述凝血酶γ环的氨基酸序列、其衍生物或其盐；以及凝血酶γ环相互作用分子，其衍生物或其盐。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是分离的肽，所述分离的肽包含所述凝血酶γ环的氨基酸序列、其衍生物或其盐。

3.根据权利要求2所述的化合物，其中所述分离的肽为直链或环状的。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中所述凝血酶γ环的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

5. 根据权利要求2或3所述的化合物，其中所述分离的肽包含如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，其衍生物或其盐。

6. 根据权利要求2或3所述的化合物，其中所述分离的肽包含如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列，其衍生物或其盐。

7. 根据权利要求2或3所述的化合物，其中所述分离的肽基本上由如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，其衍生物或其盐组成。

8. 根据权利要求2或3所述的化合物，其中所述分离的肽基本上由如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，其衍生物或其盐组成。

9. 根据权利要求2或3所述的化合物，其中所述分离的肽基本上由如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列，其衍生物或其盐组成。

10.根据权利要求1所述的化合物，其中所述γ环相互作用分子是分离的相互作用肽、其衍生物或其盐。

11.根据权利要求10所述的化合物，其中所述分离的相互作用肽为凝血酶肽。12.根据权利要求11所述的化合物，其中所述分离的相互作用肽为直链或环状的。13. 根据权利要求12所述的化合物，其中所述分离的相互作用肽包含如SEQ ID NO: 7、9、10或11中任一项所示的氨基酸序列，其衍生物或其盐。

14. 根据权利要求12所述的化合物，其中所述分离的相互作用肽基本上由如SEQ ID NO: 7、9、10或11中任一项所示的氨基酸序列，其衍生物或其盐组成。

15.根据权利要求10所述的化合物，其中所述分离的相互作用肽是从随机肽库中获得的。

16.根据权利要求15所述的化合物，其中所述分离的相互作用肽为直链或环状的。17. 根据权利要求16所述的化合物，其中所述分离的相互作用肽包含如SEQ ID NO: 12或13所示的氨基酸序列，其衍生物或其盐。

18. 根据权利要求16所述的化合物，其中所述分离的相互作用肽基本上由如SEQ ID NO: 12或13所示的氨基酸序列，其衍生物或其盐组成。

19.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至18中任一项所述的化合物以及可药用赋形剂。

20.一种凝血酶制剂，其包含凝血酶、根据权利要求1至18中任一项所述的化合物以及可药用赋形剂。

21.根据权利要求20所述的制剂，所述制剂具有约1IU/mL至10,000IU/mL的凝血酶活性。

2

CN 105683371 A

权　利　要　求　书

2/2页

22.根据权利要求20所述的制剂，所述制剂具有约10IU/mL至5,000IU/mL的凝血酶活性。

23.根据权利要求20所述的制剂，所述制剂具有约10IU/mL至1,000IU/mL的凝血酶活性。

24.根据权利要求20至23中任一项所述的制剂，其中所述化合物以约0.01mM至1mM的浓度存在。

25.根据权利要求24所述的制剂，其中所述化合物以约0.1mM至0.5mM的浓度存在。26.根据权利要求24所述的制剂，其中所述化合物以约0.5mM的浓度存在。27.根据权利要求20至26中任一项所述的制剂，所述制剂用作纤维蛋白密封剂组分。28.包含在密封容器中的根据权利要求1至18中任一项所述的化合物，根据权利要求19所述的组合物或根据权利要求20至27中任一项所述的制剂，所述密封容器具有附接于其外表面的标签。

29.一种稳定凝血酶活性的方法，所述方法包括使所述凝血酶与根据权利要求1至18中任一项所述的化合物或根据权利要求19所述的组合物接触。

30.一种筛选能够稳定液体形式的凝血酶活性的化合物的方法，所述方法包括：a) 提供分离的肽，所述分离的肽包含凝血酶γ环的氨基酸序列；b) 提供一组受试化合物；

c) 使(a)的所述分离的肽与(b)的所述一组化合物接触；以及d) 鉴定一种或多种受试化合物，所述化合物结合到所述肽；其中，所述结合表示用于稳定凝血酶活性的潜在化合物。31.根据权利要求30所述的方法，所述方法还包括分离步骤(d)中鉴定的所述一种或多种化合物。

32.根据权利要求30或31所述的方法，所述方法还包括测试步骤(d)中鉴定的所述一种或多种化合物在稳定液体形式的凝血酶活性时的效果。

33.一种编码根据权利要求2至18中任一项所述的化合物的分离的核酸序列。34.一种载体，所述载体包含根据权利要求33所述的核酸序列；其有效连接到启动子元件。

35.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求34所述的载体。

3

CN 105683371 A

说　明　书

用于稳定凝血酶活性的化合物和方法

1/20页

[0001]

序列表

[0002]本专利申请包含已经通过EFS-Web与本申请一起以ASCII格式提交的序列表，所述序列表据此完整地引入以供参考。所述ASCII副本创建于2013年10月7日，命名为“序列表”，大小为4千字节。

技术领域

[0003]本文提供了化合物、组合物和包含它们的制剂，以及可用于稳定凝血酶活性并延长凝血酶储存寿命的方法。特别地，本文公开了分离的肽，其包括凝血酶γ环的氨基酸序列，以及能够与凝血酶、组合物、制剂的γ环相互作用的分离肽，及其在液体凝血酶制剂中稳定凝血酶活性的使用方法。还提供了一种鉴定能够稳定凝血酶活性的化合物的方法。背景技术

[0004]凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，其在多种止血产品中用作活性组分。例如，纤维蛋白密封剂通常包含纤维蛋白原组分和凝血酶组分。当两种组分混合时(例如，当施用到流血的伤口或手术切口时)，形成凝血酶裂解纤维蛋白原和纤维蛋白聚合物。液体形式的浓缩纯化凝血酶在长期储存过程中显示出活性降低，最通常的结果是自溶。[0005]含有液体凝血酶的止血制剂具有特殊处理要求，以便保持凝血酶的生物活性和防止自溶性降解。例如，液体凝血酶制剂需要致冷或添加蛋白酶抑制剂以保持架藏稳定性。在

致冷并不一定总是可行的，并且杂乱的蛋白酶抑制剂可能不利地影响凝血酶的活临床中，

性。

[0006]凝血酶可被制成冻干的医药制剂，其在使用时于溶解之后使用。然而，液剂与冻干制剂相比是有利的，因为其能够被容易地被给药，无需在使用之前溶解在溶剂中的额外步骤。

[0007]其他已知的组合物和用于稳定凝血酶的方法都不尽人意，包括以下项：包含各种非特异性组分(例如，批量载体蛋白质诸如白蛋白、不同的稳定糖、一般的蛋白酶抑制剂等)；带有凝血酶活性抑制剂的凝血酶制剂，尽管其可能是有效的，但是也可能在使用过程中使凝血酶失活或抑制凝血酶，从而降低其效果。为了避免或减少抑制，在使用时，在使用之前可能需要稀释抑制剂，进而稀释凝血酶。低剂量的凝血酶制剂需要较大量的制剂的给药。

[0008]国际专利申请公布No.WO2008157304公开了使用选自苄醇或氯代丁醇和蔗糖的防腐剂稳定凝血酶溶液的方法。另外的专利公布提供了包含凝血酶和非特异性抑制剂的组合物，因此不能有效地计算凝血酶-凝血酶自溶作用。例如，美国专利No.4409334公开了固体或溶解形式的稳定化凝血酶制剂，其包含凝血酶，以及作为稳定剂的血清白蛋白连同至少一种不抑制凝血酶自身的蛋白酶抑制剂和至少一种六配位体螯合前体。[0009]欧洲专利No.EP0277096 B1提供了一种稳定的凝血酶组合物，其包含纯化的凝血酶、多元醇和缓冲液，该缓冲液包含乙酸盐或磷酸盐离子，其中制剂具有约5.0至约6.0的

4

CN 105683371 A

说　明　书

2/20页

pH。

欧洲专利No.EP 0478827 B1提供了一种稳定的凝血酶组合物，其包含三种稳定剂

的混合物：HEPES-缓冲液、硫柳汞、由胶原部分水解获得的明胶以及任选的聚凝胺。[0011]美国专利No.7351561公开了一种稳定的凝血酶制剂，其包含凝血酶和作为稳定剂的苯甲脒或对氨基苯甲脒，并且还包含作为稳定剂的氯化钙或氯化钠，至少一种缓冲物质，以及组氨酸、甘露醇、丁二酸钠、乳酸钠或精氨酸中的至少一者。

[0012]美国专利申请公布No.200901374(US 8394372)提供了一种稳定化的丝氨酸蛋白酶组合物，其包含丝氨酸蛋白酶、所述丝氨酸蛋白酶的可逆抑制剂(例如，苯甲脒、N,N-二亚乙基二胺、氨基苯甲脒)；以及稳定剂(例如，3-(N-吗啉代)丙磺酸)。[0013]描述凝血酶各个方面的非专利文献包括：Pozzi N等人，(2011年)“Rigidification of the autolysis loop enhances Na(+)binding to thrombin”(Biophys Chem.第159卷第1期，第6-13页)；Marino,F.(2010年)“Engineering thrombin 

(J Biol Chem.第285卷第25for selective specificity toward protein C and PAR1”

期，第19145-52页)；Bah A等人，(2009年)“Stabilization of the E*form turns thrombin into an anticoagulant”(J Biol Chem.第24章第284卷第30期，第20034-40页)；Yang L(2004年)“Heparin-activated antithrombin interacts with the autolysis loop of target coagulation proteases”(Blood.第104卷第6期，第1753-9页)；以及Rydel TJ等人(1994年)“Crystallographic structure of human gamma-thrombin”(JBiol Chem.第269卷第35期，第22000-6页)。[0014]因此，仍然需要可用于稳定凝血酶不进行自溶性降解同时保持其生物活性的特异性化合物。优选地，该化合物可用于浓缩的液体凝血酶制剂。发明内容

[0015]本文提供了一种化合物，其具有出色的稳定凝血酶活性的能力。该化合物能够在液剂中稳定凝血酶的活性，并且可用于延长凝血酶的储存寿命。不希望受理论的束缚，该化合物完全或部分地抑制凝血酶自溶，同时保留对其异源底物包括纤维蛋白原的凝血酶活性。

[0016]一个优点是包含该化合物的稳定化的凝血酶可被直接用于激活纤维蛋白原。可以不稀释和/或不从溶液中去除化合物而使用稳定化的凝血酶。[0017]该化合物还是有利的，因为它是有效的，并且能够被用于低浓度，因此易于在将稳定化的凝血酶制剂添加至底物时被稀释。还提供了一种包含该化合物的组合物或制剂、使用该化合物的方法以及鉴定此类化合物的方法。[0018]在一个方面，本文提供的化合物能够在液剂中稳定凝血酶的活性，其中所述化合物选自分离的肽，其包含凝血酶γ环的氨基酸序列、其衍生物或其盐；以及凝血酶γ环相互作用分子，其衍生物或其盐。在一些实施方案中，凝血酶γ环的氨基酸序列包含氨基酸序列KETWTANVGK，如SEQ ID NO:1所示。[0019]在一些实施方案中，该化合物是一种分离的肽，其包含γ环肽、此类肽或此类衍生物的衍生物或盐。

[0020]在一些实施方案中，该化合物是一种分离的γ环肽、此类肽或此类衍生物的衍生

5

[0010]

CN 105683371 A

说　明　书

3/20页

物或盐。

[0021]在一些实施方案中，肽为直链或环状的。[0022]在一些实施方案中，分离的γ环肽是直链的。[0023]在一些实施方案中，直链分离的γ环肽包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其衍生物或其盐。

[0024]在优选的实施方案中，直链分离的γ环肽、其衍生物或其盐具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

[0025]在一些实施方案中，分离的肽包含凝血酶γ环序列和位于γ环侧翼的一种或多种氨基酸。

[0026]在一些实施方案中，分离的肽在肽的每个末端包含3-4个氨基酸。氨基酸可以是例

在各种实施方案中，分离肽具有如SEQ ID 如与凝血酶γ环氨基酸序列天然相邻的氨基酸。

NO:2(GNLKETWTANVGKGQPS)所示的氨基酸序列。[0027]在一些实施方案中，分离的γ环肽是环状的。[0028]在一些实施方案中，环状分离的γ环肽包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在优选的实施方案中，环状的分离肽在γ环氨基酸序列的两端包含半胱氨酸残基，并且具有如SEQ ID NO:3(CKETWTANVGKC)所示的氨基酸序列。[0029]在一些实施方案中，其衍生物或其盐。化合物是一种凝血酶γ环相互作用分子，[0030]在各种实施方案中，相互作用分子选自分离的相互作用肽或者其衍生物，分离的抗体或其抗体片段，核苷酸适配体或肽适配体，或者此类分子的盐。在优选的实施方案中，相互作用分子为分离的相互作用肽，或者其衍生物或其盐。[0031]在各种实施方案中，分离的相互作用肽是分离的凝血酶肽，其不包含凝血酶的γ环肽，其氨基酸序列来源于直链的凝血酶氨基酸序列，或者来源于凝血酶的非直链、表面朝向的折叠氨基酸序列。例如，凝血酶肽的氨基酸序列可以基于凝血酶的三维结构，并且不一定包含凝血酶多肽的一级序列。在一些实施方案中，分离的凝血酶肽包含SEQ ID NO:7、9、10或11的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的凝血酶肽具有SEQ ID NO:7、9、10或11的氨基酸序列。在一个实施方案中，分离的凝血酶肽、其衍生物或其盐是直链的肽。在另一个实施方案中，分离的凝血酶肽、其衍生物或其盐是环状的。在一些实施方案中，环状的凝血酶肽具有如SEQ ID NO:7、9、10或11中任一项所示的氨基酸序列，并且在每个氨基和羧基端具有半胱氨酸残基。

[0032]在各种实施方案中，分离的相互作用肽，其衍生物或其盐从随机肽库中获得。在一些实施方案中，随机分离的相互作用肽包含SEQ ID NO:12或13的氨基酸序列。在一个实施方案中，随机分离的相互作用肽是直链的肽。在一些实施方案中，随机分离的相互作用肽具有SEQ ID NO:12或13的氨基酸序列。在另一个实施方案中，随机分离的相互作用肽是环状的肽。在一些实施方案中，环状的肽包含如SEQ ID NO:12或13中任一项所示的氨基酸序列，并且在每个氨基和羧基端具有半胱氨酸残基。[0033]在第二方面，本文提供的组合物包含能够在液体凝血酶制剂中稳定凝血酶活性的化合物，其中该化合物选自分离的肽，其包含凝血酶γ环的氨基酸序列、其衍生物或其盐；以及凝血酶γ环相互作用分子，其衍生物或其盐。在一些实施方案中，化合物以能有效地稳定凝血酶活性的量存在于组合物中，例如，以抑制凝血酶自溶，而不会明显地损害凝血酶生

6

CN 105683371 A

说　明　书

4/20页

物活性，以及可药用赋形剂。在一些实施方案中，凝血酶生物活性包括纤维蛋白原裂解为纤维蛋白。

[0034]在另一方面，本文提供了包含凝血酶的凝血酶制剂，能够在制剂中稳定凝血酶活性的化合物，其中该化合物选自分离的肽，其包含凝血酶γ环的氨基酸序列、其衍生物或其盐；以及凝血酶γ环相互作用分子，其衍生物或其盐；以及可药用赋形剂。[0035]在一些实施方案中，制剂或组合物包含凝血酶，其具有约1IU/mL至10,000IU/mL、约10IU/mL至5,000IU/mL，或者优选地约10IU/mL至1,000IU/mL的凝血酶活性。[0036]在制剂或组合物的优选的实施方案中，该化合物是一种分离的肽、此类肽或此类衍生物的衍生物或盐。

[0037]在一些实施方案中，相互作用的分子是来源于凝血酶的肽或者是从随机肽库中获得的。

[0038]在一些实施方案中，该化合物是来源于凝血酶的肽。[0039]在一些实施方案中，该化合物例如肽存在于约0.01mM至约20mM、约0.01mM至约1mM、约0.1mM至约1mM、约0.1mM至约0.5mM，或者约0.5mM浓度的组合物或制剂中。[0040]在一个实施方案中，化合物、组合物或制剂容纳在具有标签的密封容器中，该标签附接于容器外表面。在一些实施方案中，制剂或组合物被制备用作纤维蛋白密封剂组分。[0041]在另一方面，本发明的特征在于一种试剂盒，其包含有效量的本文所公开的化合物，以及在液剂中使用该化合物稳定凝血酶的说明。在优选的实施方案中，该化合物是一种分离的肽、此类肽或此类衍生物的衍生物或盐。[0042]在另一方面，提供了一种稳定凝血酶活性的方法，所述方法包括使凝血酶与分离的肽接触，该分离的肽包含凝血酶γ环的氨基酸序列、其衍生物或其盐，或者使用与凝血酶的γ环相互作用的分子以稳定凝血酶活性的有效量来接触凝血酶。在一些实施方案中，稳定凝血酶活性包括抑制凝血酶自溶，而不会明显地损害其生物活性。[0043]在另一方面，提供了一种稳定凝血酶活性的方法，所述方法包括使凝血酶与本文所公开的化合物或组合物接触。[0044]在另一方面，本文提供了筛选能够稳定液体形式的凝血酶活性的化合物的方法，其包括

[0045]a)提供分离的肽，其包含凝血酶γ环的氨基酸序列；[0046]b)提供一组受试化合物；

[0047]c)使用(b)的一组受试化合物接触(a)的分离的肽；以及[0048]d)鉴定一种或多种受试化合物，其结合到a)的肽。[0049]其中，结合表示可用于稳定凝血酶活性的潜在化合物。[0050]在一些实施方案中，该方法还包括分离步骤(d)中所鉴定的一种或多种化合物的步骤。

[0051]在另一方面，本文提供了筛选能够稳定液体形式的凝血酶活性的化合物的方法，其包括

[0052]a)提供分离的肽，其包含结合到固相的凝血酶γ环的氨基酸序列；[0053]b)提供γ环序列；

[0054]c)提供一组带标签的受试化合物；

7

CN 105683371 A[0055]

说　明　书

5/20页

d)在存在和不存在b)的γ环序列的情况下，使用(c)的一组受试化合物接触(a)的

分离肽；

[0056]e)在存在和不存在b)的γ环序列的情况下，测量结合到固相的带标签受试化合物的水平，

[0057]其中，在存在和不存在γ环序列的情况下，基本不变的标签水平表示化合物是用于稳定凝血酶活性的候选物。[0058]标记可以是荧光标记、放射性标记或在本领域中已知的任何其他标记。[0059]在一些实施方案中，该方法还包括测试一种或多种所鉴定的或候选的化合物稳定液体形式凝血酶活性的效果的步骤。[0060]在一些实施方案中，该方法还包括测试一种或多种所鉴定的或候选的化合物对于A-它们稳定液体形式凝血酶活性的效果以及B-肽对异源底物例如纤维蛋白原的活性抑制最小或者无抑制的步骤。

[0061]在该方法的一些实施方案中，凝血酶γ环包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在各种实施方案中，受试化合物组从随机肽库、化学化合物库、抗体库、肽噬菌体显示库、适配体库等处获得。在一些实施方案中，该化合物是安全的并且为非免疫原性。[0062]在一些实施方案中，该化合物是分离的肽。在一些实施方案中，肽为化学或重组合成的。在各种实施方案中，提供了一种由分离的核酸序列编码的重组肽。在一些实施方案中，肽包含如SEQ ID NO:1-3、7或9-13中任一项所示的氨基酸序列。[0063]本文提供了一种编码本文所公开的肽的分离的核酸序列，以及一种载体，所述载体包含编码此类肽的核酸序列并有效连接到启动子元件。还提供了一种包含此类载体的宿主细胞。可以使用标准遗传密码推测DNA序列(例如，Lehninger,A.“Principles of Biochemistry”)。

[00]参考本发明的以下具体实施方式和附图，这些以及本发明的其他方面和实施方案将会变得显而易见。

附图说明

[0065]图1提供前凝血酶分子的图示。在前凝血酶激活过程中裂解的序列如浅灰色轮廓所示。成熟α凝血酶序列以黑色表示。凝血酶一级序列中具有γ环肽序列轮廓，并且在前凝血酶分子下面单独地表示(如箭头所示，SEQ ID NO:1)。SEQ ID NO:2是一种肽，其包含具有三种和四种氨基酸的γ环序列(以括号标记)，该氨基酸分别位于N-和C-端侧翼。[0066]图2A显示了精氨酸*HCl(精氨酸)对于凝血酶的抑制作用。添加至液体凝血酶的精氨酸使得0.5％(w/v)下的凝血酶活性降低50％，2％(w/v)下的凝血酶活性降低95％以上。[0067]图2B显示了在37℃下用不同精氨酸浓度获得的浓缩凝血酶的稳定性水平。[0068]图2C示出了通过添加更多量的γ环肽至液体凝血酶(1000IU/mL)，或添加恒定(3％w/v)精氨酸浓度至液体凝血酶(1000IU/mL)，或不添加任何肽或抑制剂获得的凝血酶稳定性水平(随着时间推移剩余的％活性)的增加。测量了在37℃下，72小时和144小时之后1000IU/mL凝血酶的剩余活性。

[0069]图2D示出了通过增加γ肽的浓度所得的凝血酶活性(在10IU/mL凝血酶下测量)的％抑制。

8

CN 105683371 A[0070]

说　明　书

6/20页

图3A-3F是示出了受本文所公开的肽影响的凝血酶的稳定性或不稳定性水平的图

表。如所指出的那样，使用0.5mM的不同肽在样品瓶中温育1000IU/mL的凝血酶。在37℃下温育0、3和7天之后测量各个样品瓶中的剩余活性。将0.5mM的苯甲脒用作对照物，苯甲脒是一种凝血酶的直接活性部位抑制剂。也包括不含任何肽或抑制剂添加剂的对照组。结果按组划分：

[0071]图3A是示出使用能够结合γ环的随机肽的凝血酶(如通过测量剩余活性的％所示)的稳定性水平的图表。Rnd316(SEQ IDN NO:12)在图中作为随机1列出。[0072]Rnd155(SEQ IDNNO:13)在图中作为随机2列出。[0073]图3B是示出使用γ肽，直链肽(SEQ ID NO:2)和通过分子内S-S键合(“CS”；SEQ ID NO:3)环化的肽二者的液体凝血酶(如通过测量剩余活性的％所示)的稳定性图表。[0074]图3C是示出使用环化突变体γ环肽(SEQ ID NO:4[AL-cyc_E03N]、SEQ ID NO:5[AL-cyc_N08Y]和SEQ ID NO:6[AL-cyc_G10L])的凝血酶活性(按剩余活性的％表示)的稳定性水平的图表。

[0075]图3D是示出使用凝血酶衍生肽Thr-111(SEQ ID NO:8)的凝血酶活性(按剩余活性的％表示)的不稳定性水平。

[0076]图3E是示出使用凝血酶衍生肽Thr-069(SEQ ID NO:7)的凝血酶活性(按剩余活性的％表示)的稳定性水平的图表。

[0077]图3F是示出使用直链肽的凝血酶活性(按剩余活性的％表示)的稳定性水平的图表，在所述肽中半胱氨酸残基已经被替换为丝氨酸(SEQ ID NO:9[Thr_031_CS]、SEQ ID NO:10[Thr_032_CS]和SEQ ID NO:11[Thr_136_CS])。

[0078]图4A和4B示出了通过γ环/结合肽的凝血酶抑制(％)的水平(抑制可以从图表所示的剩余活性的％中计算得到)：凝血酶衍生肽(Thr 031 CS[SEQ ID NO:9]、Thr 032CS[SEQ ID NO:10])；环状γ肽[SEQ ID NO:3]；肽Rnd 316[SEQ ID NO:12]和直链γ肽[SEQ ID NO:1]。

具体实施方式

[0079]本公开部分地基于化合物，具体地讲，包含凝血酶γ环序列或与凝血酶γ环相互作用的某些分离肽能够在凝血酶液剂中稳定凝血酶活性的发现。[0080]“稳定凝血酶活性”是指，例如，降低凝血酶自溶活性。[0081]“稳定凝血酶活性”还可以是指在保存大于一天时(例如在室温下作为水性凝血酶溶液，例如浓缩的凝血酶溶液)仍保持凝血酶的活性，而不会明显损害凝血酶对于异源底物的生物活性，包括纤维蛋白原转换为纤维蛋白的活性。[0082]“室温”是指包括约20℃至约28℃，或者22℃至约26℃的温度。[0083]术语“稳定”是指，例如，相比于初始凝血酶活性，在凝血酶液剂内保持凝血酶活性为约80％至约100％(例如，约90至100％)的水平。[0084]术语“初始凝血酶活性”是指，例如，在融化冰冻的凝血酶制剂之后立即在凝血酶液剂中测量凝血酶对于纤维蛋白原的活性，在重建凝血酶粉末之后和/或在允许自身降解(例如，在2-8℃下存储超过一个月；在室温下例如于10IU/mL至5,000IU/mL浓度或更高浓度下存储1天以上)凝血酶的条件下存储液体凝血酶之前立即在凝血酶液剂中测量

9

CN 105683371 A

说　明　书

7/20页

凝血酶对于纤维蛋白原的活性。[0085]据发现，直链或环状(即分子内的S-S键)γ环肽或包含凝血酶γ环的连续氨基酸序列的直链或环状肽；已知与凝血酶的γ环相互作用的肽；以及随机选择的肽，其显示出与γ环的结合相互作用可稳定液体凝血酶。[0086]据发现，包含直链或环状的γ环序列(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)的肽显示出凝血酶活性的有效稳定性。在0.5mM时，环状γ肽(SEQ ID NO:3)仅表现出约7％的凝血酶抑制，直链γ肽(SEQ ID NO:1)表现出约20％的抑制。[0087]据发现，利用在γ环的残基E、N或G中突变的环状肽时，凝血酶的稳定性是低效的(分别为SEQ ID NO:4、5和6)。

[0088]根据对γ环的初始结合，选自随机库的两种随机肽(SEQ ID NO:12和13)产生了凝血酶的稳定效果。[00]分子的结合，例如肽结合至γ环，看起来是其稳定性潜能的良好预测因子。

[0090]能够与γ环肽发生相互作用的两种凝血酶衍生肽[Thr 031CS(SEQ ID NO:9)]、Thr 032CS(SEQ ID NO:10)]显示出了凝血酶稳定效果，并且在相同浓度下表现出极小的凝血酶抑制作用(例如0.5mM肽：13-14％抑制)。[0091]据发现，具有如SEQ ID NO:2、3、7、9、10、11、12和13所示的序列的肽能够稳定液体水性凝血酶。

[0092]稳定化的凝血酶，其包含根据本发明发现的分子/肽，可直接用于激活纤维蛋白原，例如无需稀释和/或去除分子/肽。[0093]对于稳定性测试，可以使用在含或不含肽的情况下存储之后的1000IU/mL凝血酶，并且可以如本文所述进行活性测试。可以在测量活性之前进行稀释(1:100)。[0094]对于抑制测试，可以在存在或不存在肽(无需稀释)的情况下对10IU/mL凝血酶的血小板凝聚活性进行测量。

[0095]凝血酶对纤维蛋白原的活性可通过测量凝血酶血小板凝聚活性进行估计。可以例如通过修改的欧洲药典测定(European Pharmacopeia Assay)(0903/1997)直接测量血小板凝聚活性，和/或通过诸如测量倾斜表面上(或下落试验模型)的迁移长度，或者通过本领域已知的任何其他方法间接测量血小板凝聚活性。[0096]本文提供的化合物是例如分离的肽，其包含凝血酶γ环序列，或其与凝血酶γ环相互作用。本文还提供了一种鉴定能够在水性液体凝血酶制剂中稳定凝血酶活性的化合物的方法。

[0097]本文所提供的化合物能够在液体凝血酶制剂中稳定凝血酶的活性。该化合物选自分离肽，其包含凝血酶γ环的氨基酸序列、其衍生物或其盐；以及凝血酶γ环相互作用分子，以及其衍生物或其盐。

[0098]包含凝血酶γ环的氨基酸序列的肽和凝血酶γ环相互作用分子不同于完整的α凝血酶。

[0099]氨基酸

[0100]氨基酸和肽序列的常用缩写如下表A所示。[0101]表A：缩写、系统命名以及常见氨基酸的化学式

10

CN 105683371 A[0102]

说　明　书

8/20页

[0103]

在一个实施方案中，使用氨基酸类似物序列，其中分离肽中的至少一个氨基酸被

类似物或生物类似氨基酸取代(保守取代)，如在本领域中已知的。[0105]氨基酸可以是L型、D型或者其衍生物(例如，伪氨基酸、官能化的氨基酸(例如氟化氨基酸等)、β氨基酸、γ氨基酸等)。[0106]凝血酶

[0107]凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，其通过另外的丝氨酸蛋白酶(因子Xa)由前凝血酶(因子II)(一种酶原)的裂解生成。人凝血酶是由两个多肽链通过接合构成的一种295个氨基酸的蛋白质

[0108]酶原前凝血酶(图1所示)在残基271处裂解，去除了整个N端的271个氨基酸。通过因子Xa在残基320处的额外分子内裂解产生了活性α凝血酶分子，其是一种由重链和轻链构

[0104]

11

CN 105683371 A

说　明　书

9/20页

成的295个氨基酸的多肽(人体)，通过单S-S键相连接(Krishnaswamy J(2013年)“The transition of prothrombin to thrombin”J Thromb Haemost.7月；11增刊1:265-76页)。凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，其能够通过在β(残基382和394)或γ(残基443和残基474)部位裂解其他凝血酶分子来引发其自身降解(“自溶”)，从而分别产生β-和γ-凝血酶。[0109]这些环不包含典型的凝血酶识别部位，此裂解也不是特定于环内的某些残基。相反，这些环是柔性和暴露的，并且在缺乏合适的底物，尤其是在高凝血酶浓度的情况下被裂解(例如参见，Chang,JY.Biochem.J.(1986年)第240卷，第797-802页，“The structures and proteolytic specificities of autolysed human thrombin”；Rydel TJ等人，J Biol Chem.1994年，第269卷第35期，第22000-6页，“Crystallographic structure of human gamma-thrombin”，Pozzi N等人，Biophys Chem.2011年，第159卷第1期，第6-13页，“Rigidification of the autolysis loop enhances Na(+)binding to thrombin”)。体内凝血酶的失活不通过这种机制(自溶)进行，而是通过与丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPIN)、抗凝血酶III(ATIII)的特定相互作用(肝素桥联)进行。

[0110]凝血酶(以及多种其他同源丝氨酸蛋白酶诸如因子X和甚至蛋白质C)与ATIII的相互作用是通过γ环介导的(参见例如Yang,L.,Blood.2004年，第104卷，第6期，第1753-9页，“Heparin-activated antithrombin interacts with the autolysis loop of target coagulation proteases”；以及Marino,F,J Biol Chem.2010年，第285卷第25期，19145-52页，“Engineering thrombin for selective specificity toward protein C and PAR1”)。

[0111]人体和非人体凝血酶可用于本发明。凝血酶具有医疗用途，例如，作为止血剂和作为组织粘合剂的组分。[0112]在一个方面，本文提供了凝血酶制剂，其包含：a)凝血酶；和b)能够稳定凝血酶活性的化合物，该化合物选自分离的肽，其包含凝血酶γ环的氨基酸序列、其衍生物或其盐；以及凝血酶γ环相互作用分子，其衍生物或其盐；以及可药用赋形剂。[0113]对于长期储存，包含凝血酶和化合物的制剂被等分到无菌样品瓶、安瓿或其他容器中，然后对其进行密封。在一个实施方案中，采用了这样的密封，即允许使用注射器通过密封件移出稳定化的凝血酶组合物。可根据药物或医疗装置领域的标准操作对容器进行标记。

[0114]在本发明的一个实施方案中，容器被设置在试剂盒中，所述试剂盒具有第二容器，所述第二容器包含支架，诸如明胶或胶原基基质。在另一个实施方案中，容器被设置在试剂盒中，所述试剂盒具有第二容器，所述第二容器包含含有纤维蛋白原的组分。药盒还可包含施用装置，诸如喷涂器、注射器等和/或稀释剂和/或使用说明。[0115]在使用过程中，稳定化的凝血酶制剂从容器中取出后可直接使用，或者可被进一步稀释到理想的浓度，通常制剂中的凝血酶活性为从约1IU/mL至约10,000IU/mL的范围内，通常约10IU/mL至约5,000IU/mL，或10IU/mL至1,000IU/mL，但实际浓度将由用户(例如，医师、护士、实习医生)决定，即根据患者个人的需要以及出血的严重性。本质上，稳定化的凝血酶可施用至出血组织以实现止血，或者可以与支架或基质，例如可吸收的支架或基质结合使用。稳定化的凝血酶制剂也可用作组织粘合剂、纤维蛋白密封剂或纤维蛋白胶的组分。凝血酶的这些以及在本领域中已知的其他用途是针对本发明所公开的稳定化的凝血酶所

12

CN 105683371 A

说　明　书

10/20页

考虑的。纤维蛋白胶在各个领域的多种用途已有报道，包括用作密封剂例如用于密封泄漏，止血剂/止血，防止粘附，增强愈合，用于接合结构，用在多种开放式和腹腔镜外科手术中。[0116]优选的止血支架是天然的或经基因工程改造的可吸收聚合物或合成的可吸收聚合物，或它们的混合物。天然的或经基因工程改造的可吸收聚合物的例子是蛋白质、多糖以及它们的组合。所述蛋白质包括前凝血酶、凝血酶、纤维蛋白原、纤维蛋白、纤粘蛋白、肝素酶、因子X/Xa、因子VII/VIIa、因子IX/IXa、因子XI/XIa、因子XII/XIIa、组织因子、巴曲酶、安克洛酶、蛇静脉酶、血管性血友病因子、胶原、弹性蛋白、白蛋白、明胶、血小板表面糖蛋白、加压素、加压素类似物、肾上腺素、选择素、促凝血毒液、纤溶酶原激活物抑制剂、血小板活化剂、具有止血活性的合成肽，和/或它们的组合。多糖包括但不限于：纤维素、烷基纤维素如甲基纤维素、烷基羟烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素硫酸酯、羧甲基纤维素的盐、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、甲壳质、羧甲基甲壳质、透明质酸、透明质酸的盐、藻酸盐、藻酸、丙二醇藻酸盐、糖原、葡聚糖、硫酸葡聚糖、凝胶多糖、果胶、普鲁兰多糖、黄原胶、软骨素、硫酸软骨素、羧甲基葡聚糖、羧甲基脱乙酰壳多糖、脱乙酰壳多糖、肝素、硫酸肝素、类肝素、硫酸类肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、角叉菜胶、脱乙酰壳多糖、淀粉、直链淀粉、支链淀粉、聚-N-葡糖胺、聚甘露糖醛酸、聚葡糖醛酸，以及任何上述物质的衍生物。合成的可吸收聚合物的例子是脂族聚酯聚合物、共聚物和/或它们的组合。[0117]前凝血酶/凝血酶分子和γ环链序列如图1所示。[0118]定义

[0119]除非上下文中明确地指出，否则本文所用的不定冠词“一个”和“一种”意为“至少一个/种”或“一个/种或多个/种”。[0120]如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”及其语法变体应视为指定所述特征、步骤或组分，但不排除一种或多种另外特征、步骤、组分或其组的添加。[0121]当数值前面有术语“约”时，术语“约”旨在表明+/－10％。[0122]如本文所用，术语“肽”广泛用于指约5至约100个连续氨基酸或氨基酸类似物的分离化合物。肽的定义包括，例如，含有一种或多种氨基酸类似物的肽(包括，例如，非天然氨基酸、类肽类等)，具有取代键，以及在本领域已知的其他修饰的，天然存在和非天然存在(例如合成)的肽。因此，该定义包括合成肽，环化肽、支链肽等。适用于本发明的肽的非性长度包括5至100(或者其间的任何整数)个残基(氨基酸和/或类似物)长度、5至20个残基长度、6至75个残基长度、10至25个残基长度、21至75个残基长度、75至100个残基长度的肽。通常，本发明可用的肽可具有适用于预期应用的最大长度。优选地，肽在约5至30个残基长度之间，例如在约5至30个连续氨基酸残基之间；例如，约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续氨基酸残基，优选地约10至17或10至15个残基的长度。[0123]此外，如本文所述的肽，例如合成肽，可包含另外的分子诸如标记或示踪剂、连接基、或者共价地附接于其上或与其非共价缔合的其他化学部分(例如生物素、染料)。此类部分还可增强肽与化合物，例如凝血酶γ环肽之间的相互作用和/或有助于检测或定量稳定化的凝血酶。

[0124]术语肽也包括本发明的氨基酸序列的衍生物，其具有一个或多个取代、加入和/或去除，包括一个或多个非天然存在的氨基酸。优选地，衍生物表现出与任何野生型或参考序

13

CN 105683371 A

说　明　书

11/20页

列至少约50％的同一性，优选地至少约70％的同一性，更优选地与本文所述的任何野生型或参考序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。肽衍生物可包括对天然序列的修饰，诸如去除、加入和取代(通常在本质上是保守的)，只要肽保持期望的活性，例如对凝血酶的稳定性。这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或者可以是意外的，诸如通过宿主的合成或突变，这会由于PCR扩增而产生蛋白质或错误。本文还涵盖肽的药学上可接受的盐，以及此类盐的衍生物。[0125]所谓“γ环肽”是指如SEQ ID NO:1所示的十(10)个连续氨基酸序列的肽，具体地为序列KETWTANVGK(LYS-GLU-THR-TRP-THR-ALA-ASN-VAL-GLY-LYS)。不希望受理论的束缚，根据该蛋白质家族的经典编号体系，凝血酶γ环的序列与牛胰凝乳蛋白酶中残基145-150是同源并且对应的，并且已被示出使用X射线晶体学来保持一般暴露的环结构。与凝血酶γ环同源的序列可被考虑为凝血酶γ环的衍生物。[0126]“凝血酶”或“凝血酶多肽”是一种哺乳动物丝氨酸蛋白酶，其属于凝血级联系统的一部分并用于将纤维蛋白原转化为纤维蛋白的不溶性链，以及催化其他凝血相关的反应。在人体中，前凝血酶通过F2基因编码，并且所得的多肽在凝血级联系统中蛋白水解裂解形成凝血酶。凝血酶用作特别是多种止血产品中的活性组分。例如，纤维蛋白密封剂通常包含纤维蛋白原组分和凝血酶组分。当两种组分混合时(例如，当施用到流血的伤口时)形成凝血酶裂解纤维蛋白原和纤维蛋白聚合物。[0127]本领域的技术人员将认识到，本文所公开的肽可被合成为肽的衍生物，包括“肽模拟物”。肽模拟物或“拟肽”是一种本质上不完全为肽的分子，但模拟其结构性基于的肽的生物活性。此类拟肽包括类似肽的分子，其含有非天然存在的氨基酸。拟肽可包括一种或者多种氨基酸类似物，并且可以是类似肽的分子，其包含，例如，酰胺键同电子排列体诸如反-逆修饰；被还原的酰胺键；亚甲基硫醚或者亚甲基亚砜键；亚甲基醚键；亚乙基(ethylene)键；硫代酰胺键；反式烯烃或氟烯烃键；1,5-双取代四唑环；酮基亚甲基或氟代酮基亚甲基键或者另外的酰胺同电子排列体。该术语还包括分子，其包含一个或多个N取代的甘氨酸残基(类肽)以及其他合成氨基酸或肽。(对于肽的描述参见，例如，美国专利No.5,831,005；5,877,278；以及5,977,301；Nguyen等人(2000年)Chem Biol.第7卷第7期，第463-473页；以及Simon等人(1992年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA第卷第20期，第9367-9371页)。本领域的技术人员应当理解，如本文所用的术语“拟肽”的意思涵盖了这些和其他拟肽。[0128]根据常规表示法书写肽的氨基酸序列，N-端的氨基(NH2)出现在序列的左侧，C-端的羧基(COOH)出现在其右侧。

[0129]本文所公开的肽可以通过常规的盐形成反应形成生理上可接受的盐。此类盐可包括具有无机酸诸如盐酸、硫酸和磷酸的盐；具有有机酸诸如乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、油酸和棕榈酸的盐；具有碱金属和碱土金属诸如钠、钾、钙和铝的氢氧化物和碳酸盐的盐；以及具有胺类诸如三乙胺、苄胺、二乙醇胺、叔丁胺、二环己基胺和精氨酸的盐。

[0130]本发明可形成链间和链内二硫键，并且涵盖了从此类二硫键的形成所得的肽。[0131]在一个实施方案中，本文所公开的肽是化学合成的。在其他实施方案中，本文所公开的肽是通过重组DNA在原核或真核宿主细胞中的表达在体内或体外产生的。[0132]在其他实施方案中，本文所公开的肽是通过载体在原核或真核宿主细胞中的表达

14

CN 105683371 A

说　明　书

12/20页

在体内或体外产生的，该载体包含编码本文公开的化合物的核酸序列。[0133]术语“分离的多核苷酸”、“分离的核酸序列”以及“分离的核酸分子”在本文中可互换使用。分离的“多核苷酸”可包括双链和单链序列，并且是指但不限于原核序列，真核mRNA，来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA，来自病毒(例如RNA和DNA病毒和反病毒)的基因组RNA和DNA序列，原核DNA或真核(例如哺乳类)DNA，以及合成DNA序列。术语还涵盖包括DNA和RNA的已知碱基类似物的序列，并且包括对天然序列的修饰，诸如去除、加入和取代(通常在本质上是保守的)。多核苷酸的修饰可以具有任意数量的作用，包括例如，促进肽在宿主细胞中的表达。通常，多核苷酸编码至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或者甚至更多个氨基酸的肽。[0134]“多核苷酸编码序列”或者“编码”所选多肽的序列是一种核酸分子，当置于合适的序列(或者“控制元件”)的控制条件下时，其被转录(就DNA而言)和翻译(就mRNA而言)成体内多肽。通过5'(氨基)端的起始密码子和3'(羧基)端的翻译终止密码子确定编码序列的边界。转录终止子序列可以被定位在编码序列的3'端。典型的“控制元件”包括但不限于转录调节子、诸如启动子、转录增强子元件、转录终止信号以及聚腺苷酸化序列；以及翻译调节子，诸如优化翻译启动的序列，例如夏因-达尔加诺(核糖体结合部位)序列、Kozak序列(即优化翻译的序列，位于例如编码序列的5'端)、前导序列(异源或天然序列)、翻译起始密码子(例如ATG)以及翻译终止序列。启动子可包括诱导型启动子(其中有效连接至启动子的多核苷酸序列的表达通过分析物、辅因子、调节蛋白等进行诱导)、阻抑型启动子(其中有效连接至启动子的多核苷酸序列的表达通过分析物、辅因子、调节蛋白等进行诱导)以及组成型启动子。

[0135]“有效连接”是指元件的排列，其中所述组分如所述配置以便执行其常规功能。因此，当存在合适的酶时，给定的有效连接至编码序列的启动子能够执行编码序列的表达。启动子无需与编码序列接续，只要其具有指导其表达的功能。因此，例如，居间未翻译而仍被转录的序列能够存在于启动子序列和编码序列之间，并且启动子序列仍然能够被视为“有效连接”至编码序列。

[0136]如本文用于描述核酸分子的“重组”核酸分子是指基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，依据其来源或操作：(1)并非与所有或部分多核苷酸相关联，其与性质相关联；和/或(2)与多核苷酸相关而不是与性质相关。如相对于蛋白质或多肽使用的术语“重组”是指通过重组多核苷酸表达产生的多肽。“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”以及表示作为单细胞实体培养的原核微生物或真核细胞系的其他此类术语可互换使用，并且是指能够，或者已经被用作构建物、载体或其他转移DNA的受体的细胞，并且包括已经被转染的原始细胞的子代。应当理解，由于意外或有意的突变，单个亲本细胞的子代的形态或者基因组或者与原始亲本互补的总DNA可能不一定完全相同。亲本细胞的子代与通过相关特性表征的亲本足够相似，诸如存在编码期望的肽的核苷酸序列，该亲本细胞的子代包括在本定义的子代中，并且涵盖在上述术语中。[0137]所谓“分离的”是指，当指多核苷酸或肽时，所指的分子或化合物是的，并且是与所述分子或化合物天然存在的整个生物系统分离的，或者当多核苷酸或肽不是天然存在的时，所指的分子或化合物完全不含其他生物大分子，使得多核苷酸或肽能够用于预期目的。

15

CN 105683371 A[0138]

说　明　书

13/20页

如本文所用，如果分子通过非共价键力例如范德华力和静电力与肽或蛋白质缔

合，则所述分子例如肽被称为与另外的肽或蛋白质(例如，凝血酶γ环相互作用分子与凝血酶)“相互作用”或“相结合”。如果与蛋白质中的另外的结构域相比，分子以更大的亲和力和/或更大的特异性与特定结构域缔合，则所述分子例如肽被称为与蛋白质中的特定结构域(例如凝血酶γ环)“优先地相互作用”。在一些实施方案中，分子例如肽优先地结合到凝血酶的γ环。应当理解，优先的相互作用不一定需要在每种肽的特定氨基酸残基和/或基序之间具有相互作用。[0139]“凝血酶活性”和“凝血酶生物活性”是指包括凝血酶介导的异源底物的转化，包括蛋白质例如纤维蛋白原转化为纤维蛋白，以及因子VIII转化为因子VIIIa、XI转化为XIa、XIII转化为XIIIa，以及因子V转化为Va。“异源底物”是一种底物，优选蛋白质底物，而不是凝血酶。在一些实施方案中，凝血酶活性是指纤维蛋白原转化为纤维蛋白。术语“不明显地损害凝血酶的(生物)活性”是指与不受抑制/未稳定化的凝血酶相比和/或与初始凝血酶活性相比，在至少60％、在至少70％和优选地在至少80％，或至少90％或更高，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％水平下保持凝血酶对于纤维蛋白原的活性。[0140]如本文所用，术语“自溶”或“自动降解”是指凝血酶不利地分子降解成失活或部分活性的形式。

[0141]如本文所公开的优选的化合物是一种能够稳定凝血酶活性的化合物，例如通过减少凝血酶自溶而不明显地影响例如对纤维蛋白原的凝血酶活性。[0142]在一个实施方案中，稳定化的水性液体凝血酶制剂在2至8℃的温度下存储一个月以上是稳定的；在37℃下存储72小时是稳定的；和/或在37℃下存储144小时是稳定的。[0143]在一些实施方案中，化合物抑制约60％至约100％或者约60％至约95％，优选地约70％至约90％的凝血酶自溶，并且保持约60％至约100％或者约60％至约95％、约70％至约90％，优选地约80％至约95％的凝血酶生物活性，例如在2至8℃的温度下以液体形式存储一个月之后；在约37℃下存储72小时之后；在约37℃下存储144小时之后。[0144]术语“亲和力”是指结合的强度，可以以解离常数(Kd)定量表示。相比于与凝血酶的另外的结构域的相互作用，本文所公开的分子例如肽与凝血酶的γ环的相互作用能够以至少2倍大的亲和力相互作用，优选地至少5倍大的亲和力，甚至更优选地至少10、20、30、40或50倍大的亲和力相互作用。结合亲和力(即，Kd)可以使用标准技术确定。[0145]术语“有效量”是指本文所公开的化合物稳定凝血酶同时基本上保持凝血酶对于例如纤维蛋白原(例如，纤维蛋白原转化为纤维蛋白)的活性所需的量。用于实现本发明中凝血酶稳定性的化合物的有效量可根据组合物/制剂中凝血酶的浓度而有所不同。此类量是指“有效量”。

[0146]“药学上可接受的”或“可药用”载体、溶剂、稀释剂、赋形剂和媒介物通常是指惰性的、无毒的固体或液体填料、稀释剂或不与本文所公开的组合物的活性成分反应的包封材料。可接受的赋形剂包括但不限于盐水、乙酸或乙酸盐、钙、钠和氯离子、甘露糖醇、白蛋白或它们的组合。

[0147]本文所用的术语“接触”具有最广义的含义并且是指任何类型的组合活动。接触包括但不限于混合、掺加和/或添加。[0148]肽合成

16

CN 105683371 A[0149]

说　明　书

14/20页

本文所公开的肽可以根据本领域中已知的方法合成，包括但不限于合成方法(例

如从单个氨基酸以化学形式合成肽)以及重组方法(例如合成编码肽的DNA和使用DNA生成重组肽)。

[0150]肽的化学合成：本文所公开的肽和编码肽的DNA可以按本领域已知的方法化学合成。合成肽的合适方法在Stuart和Young(1984年)的“Solid Phase Peptide Synthesis”，Solid Phase Peptide Synthesis,Methods Enzymol，第二版，Pierce Chemical Company，2，Academic Press,Inc.,NY(1997年)中有所描述。例如，可以使用固相合成方法或液相合成方法。固相合成通常通过采用合适的保护基团来保护氨基而实现。例如，可使用Boc(叔-丁氧羰基)或Fmoc(9-芴甲氧羰基)或它们的组合。在一个实施例中，本文所公开的肽通过以下步骤合成：1)将对应于待制备肽的C端的氨基酸残基通过氨基酸的a-COOH基团或者所购买的此类固相材料，结合到不溶于反应溶剂的固相材料；2)在朝向肽的N端方向上，在保护其他官能团诸如对应氨基酸或者肽片段的氨基而不是a-COOH基团之后，将对应的氨基酸或肽片段通过缩合成步骤1的氨基酸进行键合；3)从键合的氨基酸或肽片段中去除形成肽键的氨基保护基团诸如a-氨基；4)重复步骤2)和3)以增长肽链，以便形成对应于期望的肽的肽链；5)将生成的肽链与固相材料分开，并且从受保护的官能团中去除保护基团；以及6)纯化肽，从而获得期望的肽。

[0151]固相材料以及溶剂和缩合剂在本领域中是已知的。[0152]DNA的化学合成和表达：编码本文所公开的肽的DNA可以被复制，并且可以在多种克隆和表达载体中插入各种宿主细胞之后用于表达重组肽。宿主可以是原核的或真核的。DNA可以是化学合成的。用于合成DNA和克隆载体(例如，用于哺乳动物、昆虫或植物细胞、细菌、噬菌体和酵母)的合适方法是可获得的。可以被表达为融合蛋白的形式的重组肽通过本领域中已知的方法进行纯化。

[0153]在本发明的实施过程中可用的化合物

[0154]本文提供了用于在液体凝血酶制剂中稳定凝血酶活性的化合物和方法，其中稳定凝血酶活性是指，例如，降低或防止自溶活性，而不会明显地损害凝血酶的生物活性。所述化合物选自分离的肽，其包含凝血酶γ环肽的氨基酸序列，其衍生物或其盐；或者凝血酶γ环相互作用分子，其可以是分离的相互作用肽，其分离抗体或抗体片段，核苷酸适配体和肽适配体，此类分子的衍生物或盐。

[0155]可使用例如本公开所述的方法在筛选中鉴定与凝血酶的γ环相互作用的分子，并且可以测定其稳定凝血酶活性的能力。在一些实施方案中，相互作用分子是分离的肽、此类肽的拟肽或者此类肽的盐。本文在例如SEQ ID NO:7和9-13中提供了相互作用肽的实例。[0156]肽可为直链、支链或环状的。例如，由SEQ ID NO:1和2表示的肽是直链的，而由SEQ ID NO:3表示的肽是环状的。[0157]在一些实施方案中，相互作用分子是分离的抗体、此类抗体的片段或者此类抗体的盐。术语“抗体”是指IgG、IgM、IgD、IgA和IgE抗体，特别地包括多克隆抗体和单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体涉及凝血酶γ环，针对凝血酶γ环，和/或识别凝血酶γ环。该术语是指整个抗体或者抗体的片段，其包含抗原结合结构域，例如不含Fc部分的抗体、单链抗体、小型抗体、基本上只由变异组成的片段、抗体的抗原结合结构域等。该术语还涵盖抗体衍生物，诸如抗体片段，其保留有选择性结合其抗原或受体的能力，例证如下，特别是：

17

CN 105683371 A[0158]

说　明　书

15/20页

(1)Fab，该片段包含抗体分子的一价抗原结合片段，其可通过使用木瓜蛋白酶消

化整个抗体产生轻链和一部分重链来制备；

[0159](2)抗体的(Fab')2是两个Fab片段通过二硫键结合在一起的二聚体，可通过使用木瓜蛋白酶处理整个抗体来获得，无需后续的还原反应。[0160](3)Fv，定义为遗传工程片段，其包含轻链的变异区域以及表示为两条链的重链的变异区域；以及

[0161](4)单链抗体(SCA)，定义为遗传工程分子，其包含轻链的变异区域以及重链的变异区域，该重链通过合适的多肽连接基连接为基因融合的单链分子。[0162]在一些实施方案中，相互作用分子是适配体或者此类适配体的盐。适配体是RNA和/或DNA单链或双链寡核苷酸，其结合到目标蛋白质并且一般不表现出非特异性影响。适配体可以根据本领域技术人员已知的任何核酸修饰针对稳定性或者其他期望的性质进行修饰。可以在分子的任何位置引入对适配体的修饰，诸如5'或3'端，或者在任何体内限定的修饰部位。巯基适配体是在特定核苷酸间磷酰基部位处包含硫修饰的适配体，并且可以具有增强的稳定性、核酸酶抗性、目标物亲和力和/或选择性。巯基适配体的例子包括硫代磷酰酯(phosphoromonothioate，S-ODN)和二硫代磷酸酯(phosphorodithioate，S2-ODN)寡核苷酸巯基适配体。有关适配体和巯基适配体的更多信息可见于美国专利No.5,218,088和6,423,493。

[0163]在本发明实施过程中可用的示例性化合物的详细信息提供于下文的实施例中，并且在此一同提供了序列表。[01]筛选方法

[0165]本文提供了筛选能够稳定凝血酶活性的化合物的方法。因此，提供了筛选能够在液体凝血酶制剂中稳定凝血酶活性的化合物的方法，所述方法包括：[0166]a)提供分离的肽，其包含凝血酶γ环的氨基酸序列；[0167]b)提供一组受试化合物；

[0168]c)使用(b)的一组受试化合物接触(a)的分离的肽；以及[0169]d)鉴定一种或多种化合物，其结合到肽；[0170]其中，结合表示化合物在稳定凝血酶活性中具有潜在用途。[0171]在一些实施方案中，该方法还包括分离在步骤d)中鉴定的一种或多种化合物的步骤，和/或测试在步骤d)中鉴定的一种或多种化合物对于稳定凝血酶活性的能力的步骤。[0172]虽然下面的实施例说明了本发明的某些实施方案，但它们不应被理解为本发明的范围，而应理解为有助于完整描述本发明。[0173]实施例[0174]实施例1：凝血酶活性测定

[0175]水性液体凝血酶以其纯化和浓缩的形式1000国际单位IU/mL，可以在室温下发生自溶，导致例如对异源底物的活性发生显著损失。例如，当液体凝血酶制剂在室温下温育较长的时间(例如72至144小时)时，特别是，由于自溶降解，凝血酶对于异源底物的活性会降低。在水性液体溶液中，凝血酶对于异源底物的活性降低可以通过在较长时间后并在允许的温度(例如37℃)下测量凝血酶活性进行估计。在以下实验中，研究了不同条件下肽对于凝血酶稳定性的影响。

18

CN 105683371 A[0176]

说　明　书

16/20页

将经过水性液体纯化和浓缩的凝血酶(1000IU/mL；等同于约10μM)等分并置于37

℃培养箱中3天(72小时)、7天(168小时)和14天(336小时)。在温育之前，对凝血酶样品加入指定量的不同测试肽或者凝血酶抑制剂对照物：苯甲脒或精氨酸*HCl(“精氨酸”)。在每个实施例中均指出了所用的特异性肽及其浓度，以及凝血酶抑制剂。在温育期之后，在-80℃下冻结样品直至测试凝血酶活性。临到凝血酶活性测定试验之前，解冻所有样品，并且将其100倍稀释到稀释缓冲液中(0.4％二水柠檬酸三钠、0.9％氯化钠和1％BSA，pH＝7.5)，使样品中凝血酶的浓度在测定规定的范围内(4-10IU/mL)，并且将样品中经测试的肽稀释至可以忽略不计的浓度。

[0177]使用STart4凝血分析仪(Diagnostica Stago,Asnières sur Seine,France)通过血小板凝聚时间估计凝血酶活性。该测定是欧洲药典测定程序(European Pharmacopoeia Assay procedure)1997年，0903，第858页的修改形式。简而言之，通过混合凝血酶标样与0.1％纤维蛋白原含量的纤维蛋白原溶液制定校准曲线(Enzyme Research Laboratories,IN,USA)。然后，通过血小板凝聚时间从校准曲线计算不同测试样品中的凝血酶浓度(从校准曲线推测浓度)。

[0178]对于1000IU/mL凝血酶的稳定性测试，在含或不含肽的情况下存储之后如上所述进行测试。在测量活性之前进行稀释(1:100)。[0179]对于抑制测试，在存在或不存在肽的情况下对10IU/mL凝血酶的血小板凝聚活性进行测量。

[0180]实施例2：包含凝血酶γ环的氨基酸序列的肽对于凝血酶稳定性的影响[0181]在凝血酶形成过程中裂解的前凝血酶序列如图1中浅灰色轮廓所示。成熟α凝血酶多肽序列以黑色表示。凝血酶一级序列中具有本文使用的肽序列轮廓，并且在分子下面单独地表示(如箭头所示)。示出了γ环肽序列(SEQ ID NO:1)本身，以及括号内更长的肽，其包括位于N端和C端侧翼的氨基酸(SEQ ID NO:2；GNLKETWTANVGKGQPS；GLY-ASN-LEU-LYS-GLU-THR-TRP-THR-ALA-ASN-VAL-GLY-LYS-GLY-GLN-PRO-SER)。SEQ ID NO:1通过合成具有末端半胱氨酸残基的肽(SEQ ID NO:3；CKETWTANVGKC；CYS-LYS-GLU-THR-TRP-THR-ALA-ASN-VAL-GLY-LYS-CYS)而被环化。这些肽通过标准方法合成。

[0182]具有侧翼氨基酸(SEQ ID NO:2)和环状肽(SEQ ID NO:3)的γ环肽用于测试对凝血酶自溶活性的抑制。将精氨酸*HCl(“精氨酸”)，一种凝血酶已知活性部位抑制剂，用作对照物。图2A示出了在不同精氨酸浓度下精氨酸对于凝血酶活性的抑制作用(使用10IU/mL凝血酶测量)。图2B示出了使用不同浓度的精氨酸在37℃下温育最多48小时之后所测量的凝血酶％(如图所示)。浓缩的凝血酶用于较短的时间(最多48小时)，以便快速获得精氨酸的工作范围。精氨酸对于凝血酶稳定性显示出剂量依赖性作用，这与其抑制作用相关联，参见图2A。

[0183]图2C示出了使用增加量的γ环肽(SEQ ID NO:2)或者使用恒定浓度(3％w/v)的精氨酸温育之后凝血酶剩余的活性。该测定基于在37℃下，72小时和144小时之后测量的1000IU/mL凝血酶的剩余活性。[0184]在0.1mM肽的条件下，已于144小时之后检测到了稳定性，在0.2mM条件下，在72小时之后，这已经是明显的。图2D示出了通过增加肽的浓度所得的凝血酶活性(在10IU/mL凝血酶下测量)的抑制。在0.2mM的肽浓度下，凝血酶活性不会明显地受到影响

19

CN 105683371 A[0185]

说　明　书

17/20页

结果：0.5-5％(w/v)范围内的精氨酸在存储之后保持了凝血酶的活性(图2B)。然

而，精氨酸的存在损害了凝血酶的生物活性(参见图2A)。即使在0.5％(w/v)的精氨酸条件下，约50％(w/v)的凝血酶活性被抑制，并且大于95％的凝血酶活性在2％(w/v)的浓度下被抑制(如根据其裂解纤维蛋白原的能力所测定；图2A)。基于有效精氨酸浓度，将3％(w/v)的精氨酸与0.5mM浓度的γ环肽相比较(SEQ ID NO:2；图2C)。出乎意料的是，当在0.5mM的稳定浓度下使用肽时，凝血酶保持较高的活性(约80％的剩余活性，参见图2D)。在该相同的实验中，3％(w/v)精氨酸在保持凝血酶活性72小时后并不是更加有效，并且在144小时后只有少量效果。明显地，可以推测(基于图2A)3％(w/v)精氨酸浓度能够抑制几乎全部凝血酶。[0186]在0.5mM浓度的肽条件下，观察到凝血酶稳定性增大(图2C)，同时凝血酶对于纤维蛋白原的活性仅减少了20％(图2D)。不希望受理论的束缚，γ环肽看起来至少部分地为凝血酶降解的变构抑制剂。[0187]实施例3：筛选突变γ环肽

[0188]进行筛选以鉴定γ环突变体，该突变体对于凝血酶可显示出改善的结合。使用荧光凝血酶对一系列γ环肽突变体进行筛选。测定具有最高结合效率的三种此类环化肽稳定凝血酶而不会损害凝血酶对于纤维蛋白原的活性的能力(参见下文实施例4)。[01]“γ环”(SEQ ID NO:1)示出了凝血酶γ环的野生型序列；E03N是指天冬酰胺在位置3处取代谷氨酸(在SEQ ID NO:4中)；N08Y是指酪氨酸在位置8处取代天冬酰胺(在SEQ ID NO:5中)；G10L是指亮氨酸在位置10处取代甘氨酸(在SEQ ID NO:6中)。[0190]肽的氨基酸序列在本文下表1中示出：[0191]表1：突变的γ环肽

[0192]

实施例4：筛选γ环结合肽

[0194]基于在实施例2中公开的结果，将γ环肽用作诱饵以找到可以积极影响凝血酶稳定性的其他肽。为此，使用经若干肽阵列温育的荧光γ环肽进行结合筛选。[0195]生成1,67615-meric肽的库，其覆盖了与凝血酶的γ环相互作用的蛋白质序列，诸如凝血酶本身、抗凝血酶III(ATIII)、血栓调节蛋白、肝素辅因子II、牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)，以及水蛭素和凝血酶γ环序列的修饰物。使用SPOT合成法(Wenschuh H等人，(2000年)，Coherent membrane supports for parallel microsynthesis and screening of bioactive peptides.Biopolymers，第55卷，第188-206页)来合成肽，并且如(Panse S等人，(2004年)，Profiling of generic anti-phosphopeptide antibodies and kinases with peptide microarrays using radioactive and fluorescence-based assays.Mol 

20

[0193]

CN 105683371 A

说　明　书

18/20页

Divers，第8卷，第291-299页，第2版)所述将其化学选择性地固定到官能化的玻片上。将每种肽一式三份地印刷到芯片上。针对结合研究，使用DyLight 650(

微量抗体标记

试剂盒，Thermo Scientific,#84536)直接标记100μg经纯化的凝血酶(Omrix biopharmaceuticals)，并且在封闭缓冲液(SuperBlockT20(TBS)封闭缓冲液，Thermo Scientific,#37536)中进行稀释。使用10μg/mL DyLight 650-凝血酶或荧光素标记的环状γ环衍生肽将所述芯片在HS4800芯片处理站中(Tecan)(Masch A，等人，(2010年)，Antibody signatures defined by high-content peptide microarray analysis.Methods Mol Biol，第669卷，第161–172页)于30℃下温育1小时。[0196]使用0.1％的Tween-20在1XTBS中清洗芯片，之后使用0.05％的Tween-20在0.1XSSC中清洗，并且在氮气流下干燥。使用GenePix Autoloader 4200AL(Molecular Devices，像素大小：10μm)扫描每个芯片。使用点识别软件Genepix Pro 7.0分析软件(Molecular Devices)评估信号强度。针对每种肽，提取三次重复的平均信号强度。使用统计计算和图形软件R(版本2.11.1，www.r-project.org)对结果执行另外的评估和表示。[0197]一个阵列包括基于凝血酶序列的肽。从该库中分离的任何肽可以反映凝血酶蛋白质中可以与γ环相互作用的可能区域。第二阵列由随机肽组成，其中若干随意的肽显示出对γ环的亲和力。根据0-65535(216)的任意比例定量最强结合候选物(hits)的荧光。如实施例1所述的方法估计凝血酶活性。[0198]在筛选中，从凝血酶衍生肽阵列(Thr；SEQ ID NO:7-11)和随机肽阵列(Rnd；SEQ ID NO:12-13)中鉴定出的候选肽的氨基酸序列如本文下表2所示：[0199]表2：不同γ环相互作用肽的结合和序列

[0200]

带下划线和粗体的是S取代。[0202]如实施例2所述，测试了所有这些肽(实施例3中鉴定的“突变体γ环肽”、随机肽、凝血酶衍生肽以及上述“γ环结合肽”)在0.5mM浓度下稳定凝血酶活性的能力。[0203]结果示于图中，如下：

[0204]图3A示出了使用结合到γ环的随机候选肽(由SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13表示的随机肽)时，凝血酶活性的稳定性水平(按剩余活性的％表示)。[0205]图3B示出了使用包含γ环序列、“直链γ肽”(SEQ ID NO:2)和通过分子内S-S键的“环状γ肽”(“CS”，SEQ ID NO:3)的肽时凝血酶活性的稳定性水平(按剩余活性的％表示)。[0206]图3C示出了使用通过分子内S-S键而环化的γ环突变肽时，凝血酶活性的稳定性

[0201]

21

CN 105683371 A

说　明　书

19/20页

水平(按剩余活性的％表示)，以及显示了增强的对凝血酶的结合。

[0207]图3D示出了使用凝血酶衍生肽Thr-111(SEQ ID NO:8)时凝血酶活性的稳定性水平(按剩余活性的％表示)。结果显示将Thr-111(SEQ ID NO:8)结合到凝血酶增加了凝血酶降解，尽管看起来未在活性部位处结合。

[0208]图3E示出了使用凝血酶衍生肽Thr-069(SEQ ID NO:7)时凝血酶活性的稳定性水平(按剩余活性的％表示)。结果显示Thr-069(SEQ ID NO:7)表现出非常弱的对凝血酶的结合，还显示其对于凝血酶稳定性具有最小的影响。

[0209]图3F示出了使用凝血酶衍生肽的突变体时凝血酶的稳定性水平(按剩余活性的％表示)，其中半胱氨酸残基已经被丝氨酸残基替代，显示出对于γ环具有可变结合，并且全部水平均表明结合在凝血酶被抑制时有所降低。凝血酶肽的氨基酸序列基于凝血酶的三维结构，并且不一定包含凝血酶多肽的连续序列。凝血酶衍生肽的所有三种突变体均能够稳定凝血酶。有效性最低的肽Thr-136CS(SEQ ID NO:11)也具有最弱的荧光信号(表2，对凝血酶的结合最弱)。

[0210]来自表2的数据和图3A-3F表明：

[0211]包含直链或环状的γ环序列(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)的肽显示出凝血酶活性类似且有效的稳定性(图3B)。

[0212]相对较弱的凝血酶相互作用肽[诸如Thr-069(SEQ ID NO:7)]和Thr-136CS[SEQ ID NO:11)]比相同基团的类似肽表现出更弱的稳定化作用(图3E和3F)。

[0213]具有与凝血酶的最强相互作用的肽Thr-111(SEQ ID NO:8)对凝血酶具有去稳定化作用(图3D)。

[0214]利用在γ环的残基E、N或G中突变的环状肽时，凝血酶的稳定化作用非常低效(分别为SEQ ID NO:4、5和6)(图3C)。因此，γ环肽和凝血酶之间的相互作用是特异性的，如果关键残基发生突变，即使结合亲和力可以增大，稳定化作用作用也可能会丢失。

[0215]两种随机肽(SEQ ID NO:12和13)均会对凝血酶产生一些稳定化作用(图3A)。如上所述，根据它们对γ环的初始结合从随机库中选择这些肽，并且其看起来是它们的稳定化能力的良好预测因子。[0216]实施例5：测试肽对于凝血酶的抑制活性

[0217]针对肽在凝血酶活性对异源底物方面的影响，对表现出凝血酶稳定化活性的肽进行测试。

[0218]该测定如实施例1所述进行。

[0219]图4A和B示出了γ环/凝血酶γ结合肽的凝血酶抑制的水平(该抑制可以按图中所示的剩余活性的％来计算)。

[0220]图4示出了两种凝血酶衍生肽[Thr 031 CS(SEQ ID NO:9)]、Thr 032 CS(SEQ ID NO:10)]，在相同浓度下，两种肽均显示出对凝血酶的一些稳定化作用，也表现出对凝血酶的抑制作用(例如，0.5mM肽：13-14％抑制)。在更高的肽浓度下(1mM)，抑制率大于30％。在0.5mM时，环状γ肽(SEQ ID NO:3)仅表现出约7％的凝血酶抑制，同时直链γ肽(SEQ ID NO:1)表现出约20％的抑制(图2D)。在该浓度下，两种肽均显示出对凝血酶的类似稳定化作用。在所测试的任何浓度下，肽Rnd 316(SEQ ID NO:12)显示对凝血酶活性绝对无抑制。[0221]在该测定中，相同浓度(0.5mM)下苯甲脒显示出20％的抑制，其比任何所测试的肽

22

CN 105683371 A

说　明　书

20/20页

都高。

这些数据表明可以使用特异性肽用于稳定凝血酶，而不损害凝血酶活性(与苯甲

脒的使用相比)。

[0223]图4B示出了通过直链(SEQ ID NO:1)和环状(SEQ ID NO:3)凝血酶γ环肽的凝血酶抑制率(该抑制可以按图中所示的剩余活性的％来计算)。[0224]在0.5mM时，环状γ肽(SEQ ID NO:3)仅表现出约7％的抑制，直链γ肽(SEQ ID NO:1)表现出约20％的抑制。在该浓度下，两种肽均显示出对凝血酶的类似稳定化作用。[0225]总之，不希望受理论的束缚，三类肽显示为能稳定凝血酶：[0226]1)直链或环状(即分子内S-S键)γ环肽或直链或环状肽，其包含凝血酶γ环的连续氨基酸序列；

[0227]2)选自已知与凝血酶相互作用的分子的肽，诸如凝血酶本身，但是也可包括抗凝血酶III、血栓调节蛋白或者其他显示为结合γ环的肽；[0228]3)随机选择的肽，其显示出与γ环具有结合的相互作用。[0229]一般来讲，以上肽在其稳定凝血酶的相同浓度下不抑制凝血酶。凝血酶是活性的并且是稳定的，因此这些肽可用于稳定液剂中的凝血酶活性，从而保留其对于异源底物的活性。

[0230]虽然本申请已描述了多种实施方案，但可以对这些实施方案进行多种修改和变型。另外，凡是公开的用于某些组件的材料，均可使用其他材料。上述具体实施方式和下述权利要求旨在涵盖所有这样的修改和变化形式。

[0231]以引用方式全文或部分地并入本文的任何专利、公布或其它公开材料均仅在所并入的材料不与本公开所述的现有定义、陈述或其它公开材料相冲突的范围内并入本文。因此，并且在必要的程度下，本文明确阐述的公开内容取代以引用方式并入本文的任何冲突材料。

[0232]本申请中的任何参考文献的引用或鉴定不应解释为对此类参考文献可用作本发明的现有技术的承认。

[0233]本文使用了小节标题以便于理解本说明书，不应将其理解为必要的。

[0222]

23

CN 105683371 A

序　列　表

1/4页

[0001]

24

CN 105683371 A

序　列　表

2/4页

[0002]

25

CN 105683371 A

序　列　表

3/4页

[0003]

26

CN 105683371 A

序　列　表

4/4页

[0004]

27

CN 105683371 A

说　明　书　附　图

1/7页

图1

28

CN 105683371 A

说　明　书　附　图

2/7页

图2A

图2B

29

CN 105683371 A

说　明　书　附　图

3/7页

图2C

图2D

30

CN 105683371 A

说　明　书　附　图

图3A

图3B

31

4/7页

CN 105683371 A

说　明　书　附　图

图3C

图3D

32

5/7页

CN 105683371 A

说　明　书　附　图

图3E

图3F

33

6/7页

CN 105683371 A

说　明　书　附　图

7/7页

图4A

图4B

34