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滨州医学院学报２００６年ｌＯ月第２９卷第５期ＢＭＣ Ｊｏｕｒ Ｑ ： ！： ： ： ・３４５・ 。・ 综述・。 Ｒｉ质粒介导的毛状根技术在获得人参药用成分 研究中的应用 姚庆收武玉永刘凤 滨州医学院生物技术教研室滨州市２５６６０３ 【关键词】 人参；Ｒｉ质粒；毛状根 【中图分类号】 Ｒ９１５ 【文献标识码】 Ａ【文章编号】 １００１－９５１０（２００６）０５－０３４５－０３ Ｒｉ质粒介导的毛状根技术是２０世纪８０年代 研究中的应用 后期，在植物细胞培养技术领域中发展起来的一项 众多的学者已经对人参毛状根体系的建立，不 新技术。它是将发根农杆菌含有的Ｒｉ质粒中的Ｔ— 同的培养基成分、菌株、诱导子对毛状根生成以及对 ＤＮＡ片段整合到植物细胞的ＤＮＡ上，诱导出毛状 产生次生物质的影响，人参毛状根生理生化活性，利 根，从而建立起毛状根培养系统用于次生代谢物的 用人参毛状根合成其他药物成分以及人参毛状根的 生产ｌ１］。由于Ｒｉ质粒转化的毛状根具有生长快、易 生物反应器培养等方面进行了大量的工作，为获取 于培养、有用成分高、代谢通路表达完整的特点＿２］， 人参药物成分的工业化生产奠定了基础。 在利用生物技术生产药用植物有效成分领域，显示 ２．１ Ｒｉ质粒介导的人参毛状根转化体系建立的研 出极大的应用潜力和广阔的发展前景。在利用Ｒｉ 究最早在１９８７年，Ｙｏｅｈｉｋａｗａ等＿８］通过诱导人参 质粒介导的毛状根技术生产人参皂苷、人参多糖等 的原生质体获得转化的毛状根，并首次证明人参毛 次生代谢物方面已经做了大量的研究。本文就该方 状根完全有可能代替天然人参作药用。Ｉｎｏｍａｔａ 而的研究作一综述 等＿９］报道人参毛状根在培养的前两周生长很快，通 １ Ｒｉ质粒转化形成毛状根的机制［３－７］ 过问隔一定时间更换培养基可保持毛状根的快速生 Ｒｉ质粒是位于发根农杆菌染色体之外的 长，培养３２ ｄ总人参皂苷含量相当于田间栽培５年 的双链环状ＤＮＡ．一般在１８０—２５０ ｋｂ之间，具有２ 生人参根中的皂苷含量水平。刘峻等 １们首次从人 个非常主要的功能区：Ｔ．ＤＮＡ区（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ＤＮＡ 参带叶幼茎处诱导出毛状根．并证实了在转化细胞 ｒｅｇｉｏｎ）和Ｖｉｒ区（ｖｉｒｕｌａｎｅｅ ｒｅｇｉｏｎ）。农杆碱型Ｒｉ质 中有农杆菌Ｒｉ质粒Ｔ．ＤＮＡ特异的表达产物冠瘿 粒上的Ｔ．ＤＮＡ是不连续的．分为ＴＬ．ＤＮＡ和ＴＲ— 碱。 ＤＮＡ。ＴＲ．ＤＮＡ上带有编码农杆碱合成酶基因 ２．２不同发根农杆菌株、培养基及成分、植物激素 （ａｇｓ）和生长素合成酶基因（ｔｍｓ．１和ｔｍｓ－２），后者指 和诱导子等对人参毛状根生长及药效成分的影响 导ＩＡＡ的合成。 人参毛状根培养的最终目的是获得人参药用成分， 发根农杆菌侵染形成毛状根的过程可分为四个 对不同的发根农杆菌株、培养基及成分、植物激素和 步骤：①发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细 诱导子等条件的研究及其合理优化是提高人参毛状 胞合成一种特殊的小分子化合物．如酚类化合物，从 根生长量和药用成分的重要条件。 而诱导Ｒｉ质粒的Ｖｉｒ区基因群活化；②在Ｖｉｒ基因 现有资料表明不同的菌株诱导毛状根的状况不 表达产生的酶的作用下，Ｔ．ＤＮＡ被切下；③Ｔ．ＤＮＡ 同，刘峻等¨们用发根农杆菌１６０１、ＬＢＡ９１８、Ｒ１０００、 转移到植物细胞并整合到植物基因组ＤＮＡ；④Ｔ． Ａ４和１５８３４等５种不同发根农杆菌感染人参，只有 ＤＮＡ在植物细胞中得到转录和翻译，发挥其机能． 菌株１５８３４可转化人参毛状根。赵寿经等… 利用 刺激植物细胞形成毛状根。 Ａ４菌株成功诱导了人参毛状根。而Ｓｈｕ等 １ ］认为 ２ Ｒｉ质粒介导的毛状根技术在获取人参药用成分 农杆菌ＡＴＣＣ１５８３４形成的毛状根中人参皂苷的产 维普资讯 http://www.cqvip.com
・３４６・ 滨州医学院学报２００６年ｌ０月第２９卷第５期ＢＭＣ Ｊｏｕｎａｒｌ，Ｏｃｔ ２００６．Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．５ 量高于农杆菌ＭＡＦＦ０３－Ｏ１７２４形成的人参毛状根。 由农杆菌ＡＴＣＣ１５８３４［１２］、农杆菌ＫＴＣＴ２７４４［１ ３＿分别 转化成的毛状根，在不同的培养条件下，分别生长最 好，人参皂苷的产量最高。Ｌｉｕ等［１ ｊ研究认为Ｒｉ质 粒中Ｔ．ＤＮＡ片段中ｒｏｌＡ、ｒｏｌＢ基因对毛状根中人参 皂苷产量的影ｎ￣ｔＯｂ．而ｒｏｌＣ基因对人参毛状根中 人参皂苷产量的提高具有重要作用。 孙彬贤等 ｌ ］研究了由发根农杆菌１５８３４诱导 的人参毛状根在不同培养基上的生长和人参皂苷的 含量变化，确定了最佳的培养基和培养条件。培养 基中不同的元素成分也对人参毛状根皂苷的生成有 重要影响。硝态氮源有助于人参毛状根中人参皂苷 的生产，而氨态氮源抑制人参皂苷的生产；增加培养 基中大量元素钾、镁、钙的含量或降低微量元素钴、 铜、碘的含量能提高人参皂苷的产量，提高锰的含量 也有提高人参皂苷产量的效果 ｌ 。 周倩耘等 ｌ ］认为适宜浓度的ＩＡＡ、ＩＢＡ、ＮＡＡ、 ２．４．Ｄ植物激素．均可不同程度地促进人参毛状根 的生长以及皂苷的积累．同时能影响单体皂苷的分 布。刘峻等 认为用ＮＡＡ、ＫＴ和乙酰丁香酮处理 可提高人参毛状根转化率并缩短转化时间。 周倩耘等¨８ｌ研究了诱导子水杨酸（ｓＡ）、酵母 提取物（ＹＥ）、ＡｇＮＯ 和ＣａＣ１，对人参毛状根中皂苷 含量的影响，认为诱导子可能是调节人参毛状根中 皂苷积累的有效物质，而且ｓＡ能促进人参皂苷分 泌到细胞外并在培养液中积累。刘峻等 ９＿认为真 菌诱导子不但能影响人参毛状根总苷的合成量，也 能使某些单体皂苷消失或增加．同时也影响人参毛 状根的生物量．培养过程中通过外源性诱导子的添 加．有利于人参毛状根次生代谢产物的定向积累。 化学诱导子茉莉酮酸有显著促进人参毛状根中人参 皂苷积累和提高人参皂苷Ｒｂ族所占比例的作 用 。 ２．３人参毛状根生理生化活性的研究 刘峻等［２１］ 对人参愈伤组织及转化的毛状根在生长周期中ＡＴＰ 的动态含量进行测定和比较．相对人参愈伤组织．人 参毛状根是分生代谢能力较强的组织．其次生代谢 产物人参皂苷的合成能力也较愈伤组织强。他们又 研究了人参毛状根培养过程中对３种重要活性氧 ＲＯＳ清除能力的动态变化．结果符合人参毛状根生 长的Ｓ型曲线．印证了人参毛状根的生长和衰老过 程［２ 。初步验证了毛状根是一类分生代谢能力很 强的组织。 ２．４利用人参毛状根进行生物转化的研究用植 物培养物对外源底物进行生物转化，从而对其结构 进行修饰．以获得更有意义的产物的研究报道很多． 也是当今研究的热点 。 赵明强等［２ ］对人参毛状根转化熊果苷的基本 条件进行了初步探讨．并获得了转化产物熊果苷，栗 建明等 进一步对此转化产物进行了分离鉴定，认 为用人参毛状根能够将氢醌转化为熊果苷。蔡洁 等［２ 利用人参毛状根生物转化合成了天麻素。还 有学者利用人参毛状根进行毛地黄毒苷元（ｄｉｇｉｔｏｘｉ． ｇｅｎｉｎ） ６＿和１８Ｂ．甘草亭酸（１８Ｂ．ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ） 的生物转化．获得了多种酯化和糖基化产 物。 ２．５人参毛状根的生物反应器培养 生物反应器 培养是实现＿Ｔ业化生产的前提。人参细胞的工业化 大规模培养早在２０世纪８０年代已经在日本实现， 人参不定根的大规模反应器培养也在韩国投产 ２ 。 由于毛状根培养在植物组织和细胞培养中所具有的 优势，开发人参毛状根的生物反应器培养研究将为 人参药用成分的大规模工业化生产带来更大的机 会。 Ｐａｌａｚｏｎ等 ］进行了人参毛状根的生物反应器 培养研究．认为在各种反应器中，波浪式反应器最利 于人参毛状根的生长．定期补充和更新培养基以及 长期培养．可以提高人参毛状根的产率和合成人参 皂苷的能力。Ｊｅｏｎｇ等 ｏ］的实验表明，在５ Ｌ的生 物反应器中．经过３９ ｄ的培养，毛状根的生物量是 接种时的５５倍：在１９ Ｌ的生物反应器中，经过４０ ｄ 的培养．毛状根的生物量是接种时的３８倍。 ３ 展望 综上所述．Ｒｉ质粒介导的毛状根技术在获得人 参药用成分方面得到了大量的应用，但在基础研究 方面研究的较多．且大部分研究都局限于实验室。 真正能应用于Ｔ业化生产的研究还比较少，虽然有 报道人参毛状根培养已开发成商品投人市场［３ ，但 是现在在人参药材的应用上仍然以栽培为主，２００４ 年的栽培人参干品产量大约在５ ０００～５ ５００吨 。 而通过生物技术生产人参药用成分上占据的比例非 常小。在目前状况下，大规模的种植，所带来的问题 也是比较突出 。加快生物技术在获取人参药用 成分中的应用．必将缓解这一系列的问题。 毛状根技术作为重要的细胞Ｔ程技术之一，加 快人参毛状根生成药用成分代谢途径和机制的 研究、建 新的毛状根培养方法和毛状根大规模培 养技术、 研制新型的生物反应器、积极进行Ｒｉ质粒 维普资讯 http://www.cqvip.com
速 医学 学报２０ｏ６年１Ｏ月第２９卷第５期ＢＭＣ Ｊｏｕｒｎａ１．０（．ｔＬ ２００６．Ｖ０１．２９．Ｎ０．５ ・３４７・ 介导外源基因在人参毛状根中表达的研究等，将为 人参毛状根技术在人参药用活性成分的工业化生产 １６．Ｙｕ Ｋ Ｗ，Ｈａｈｎ Ｅ Ｊ，Ｐａｃｋ Ｋ Ｙ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＮＨ４ ：ＮＯ１一ｒａｔｉｏ ａｎｄ ｉ． ｏｎｉｃ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｏｎ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｒｏｏｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ 提供重要的技术支持，特别是毛状根大规模培养技 术和新型生物反应器的研究将为人参药用成分的工 ｉｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ ＣＡ Ｍｅｙｅｒ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕ］． ｔｕｒｎ，２００１，５６０：２５９ 业化生产提供广阔的前景。 参考文献 １．芮和恺．药用植物毛状根的研究和应用［Ｊ］．自然杂志，１９９７，１９ （１）：２３ ２．刘军，彭菲．Ｒｊ质粒介导药用植物的研究进展［Ｊ］．湖南中医学 院学报，２００４，２４（３）：６ｌ ３．刘琴，吴震，翁忙玲，等．发根农杆菌Ｒｉ质粒及其在植物科学中的 应用［Ｊ］．生物技术通报，２００２，（５）：２ｌ ４．王关林．发根农杆菌Ｒｊ质粒载体转化．植物基因工程原理与技术 ［Ｍ］．北京：科学出版社，１９９８．２３７ ５．管延英，燕飞，杨小楼．发根农杆菌转化药用植物研究进展［Ｊ］．保 定师范专科学校学报，２００３，１６（２）：２４ ６．罗成科，彭正松。蒲利民．发根农杆菌介导的药用植物遗传转化 ［Ｊ］．生物技术，２００４，１４（１）：５８ ７．王占斌，徐香玲，孙仲平，等．发根农杆菌Ｒｉ质粒在药用植物生物 工程中的应用［Ｊ］．生物技术，２００２，１２（３）：４３ ８．Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｔ．Ｆｕｍｙａ Ｔ．Ｓａｐｏｎｉａ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｐａｎａｘ ｇｉｎ－ ｓｅｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ， １９８７，６（６）：４４９ ９．１ｎｏｍａｔａ Ｓ，Ｙｏｋｏｙａｍａ Ｍ，Ｇｏｚｕ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｇｒｏｗｔｈ ｐａｔｔｅｒｎ ａｎｄ ｇｉｎｓｅｎ－ ｏｓｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ ｒｏｏｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，１９９３，１２：６８１ １０．刘峻，丁家宜，徐红，等．Ｒｉ质粒人参转化系统的建立及鉴定［Ｊ］． 中国中药杂志，２００１，２６（２）：９５ ｌ１．赵寿经，杨振堂，李昌禹，等．发根农杆菌诱导人参产生发根及离 体发根中人参皂甙含量的测定［Ｊ］．吉林农业大学学报，２００１，２３ （２）：５７ １２．Ｓｈｕ Ｗ，Ｙｏｓｈｈｉｍａｔｓｕ Ｋ，Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ Ｋ．Ｈｉｇｈ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｉｎｓｅｎ－ ｏｓｉｄｅｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｒｏｏｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｐａｎａｘ￣ｎｓｅｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂａｓａｌ— ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ ｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．Ｋｏｌｕｒｉｔｓｕ ｌｙａｋ－ ｗｈｉｎ Ｓｈｏｋｗｈ ｉｎ Ｅｉｓｅｉ Ｋｅｎｋｙｎｓｈｏ Ｈｏｋｏｋｕ，１９９９，ｌ １７：１４８ １３．Ｊｅｏｎｇ ＧＴ，Ｐａｒｋ ＤＨ，Ｒｙｕ ＨＷ，ｅｔａ１．Ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓ－ ｆｏｒｍｅｄ Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ ｈａｉｒ ｒｏｏｔｓ ｉｎ ｆｌａｓｋ ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ— ｏｌ，２００２，（９８／１００）：ｌ２９ １４．Ｌｉｕ Ｊ，Ｄｉｎｇ ＪＹ，Ｗａｎｇ ＪＢ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ Ｃ．Ａ．Ｍｅｙ．Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｏｏｔ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ（Ｒｉ）ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ－ ｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ Ｍａｔｅｒ，２００１，２６（２）：９５ ｌ５．孙彬贤，杨光孝，汪沁琳，等．人参毛状根合成人参皂苷培养条件 的优化［Ｊ］．中成药，２００３，２５（９）：７４６ ｌ７．周倩耘，丁家宜，刘峻，等．植物激素对人参毛状根生长和皂甙含 量的影响【Ｊ］．植物资源与环境学报，２００３，１２（１）：２６ ｌ８．周倩耘，周建民，刘峻，等．诱导子对人参毛状根中皂苷含量的影 响［Ｊ］．南京军医学院学报，２００３，２５（２）：７６ ｌ９．刘峻，丁家宜，周倩耘，等．真菌诱导子对人参毛状根皂苷生物合 成和生长的影响［Ｊ］．中国中药杂志，２００４，２９（４）：３０２ ２０．Ｙｕ ＫＷ，Ｇａｏ ＷＹ，Ｓｏｎ ＳＨ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃ． ｔｉｏｎ ｂｙ ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｏｔｈｅｒ ｅｌｉｃｉｔｏｒｓ ｉｎ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｇｉｎｓｅｎｇ（Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）［Ｊ］．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｐｌａｎｔ，２０００，３６（５）：４２４ ２１．刘峻，丁家宜，张婷．人参毛状根及愈伤组织中ＡＴＰ动态变化的 生物发光法测定［Ｊ］．植物资源与环境学报，２００１，１０（２）：６ｌ ２２．刘峻，丁家宜，周倩耘．人参毛状根培养过程中对活性氧清除能 力的动态变化［Ｊ］．植物资源与环境学报，２００２，ｌ１（４）：２２ ２３．赵明强，丁家宜，刘峻，等．人参毛状根生物合成熊果苷的研究 ［Ｊ］．中国中药杂志，２００１，２６（１２）：８ｌ９ ２４．栗建明，赵明强，丁家宜．人参毛状根生物合成熊果苷的分离与 鉴定［Ｊ］．植物资源与环境学报，２００４，１３（１）：６０ ２５．蔡洁，丁家宜，华亚男，等．人参毛状根生物合成天麻素转化体系 的建立【Ｊ］．植物资源与环境学报，２００５，１４（２）：２９ ２６．Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｋ，Ｈｉｒｏｔａｎｉ Ｍ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａｅｔａｌ Ｔ．Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｇｉｔｏｘｉｇｅｎｉｎ ｂｙ Ｇｉｎｓｅｎｇ Ｈａｉｙｒ Ｒｏｏｔ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］，Ｐｈｙｔｏｅｈｅｍｉｓｔｙｒ， １９９０，２９（３）：８３７ ２７．Ａｓａｄａ Ｙ，Ｓａｉｔｏ Ｈ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ １８－ｇｌｙｃｙｒ－ ｒｈｅｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ Ｇｉｎｓｅｎｇ Ｈａｉｒｙ Ｒｏｏｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｙｒ， １９９３，３４（４）：１０４９ ２８．陈巍，高文远，贾伟，等．人参属药用植物组织和细胞培养的研究 进展［Ｊ］．中草药，２００５，３６（４）：６１６ ２９．Ｐａｌａｚｏｎ Ｊ，Ｍａｌｌｏｌ Ａ，Ｅｉｂｌ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈａｉｒｉｎｇ ｒｏｏｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ ｕｓｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ，２００３，６９（４）：３３４ ３０．Ｊｅｏｎｇ ＧＴ，Ｐａｒｋ ＤＨ，Ｈｗａｎｇ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｃｈａｒａｅ－ ｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ ｈａｉｒｉｎｇ ｒｏｏｔｓ ｖａｒｉｏｕｓ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３，（１０５—１０８）：４９３ ３１．胡之璧．生物技术在传统药材中的应用前景『Ｊ１．药学服务与研 究，２００２，２（１）：ｌ ３２．丁乡，丁立威．国宝人参曙光再现——东北三省人参市场现状与 后市浅析【Ｊ］．中国中医药报，２００５，ｌ１：２ ３３．高文远，贾伟，段宏泉，等．药用植物发酵培养的工业化探讨［Ｊ］ 中国中药杂志，２００３，２８（５）：３８５ （收稿日期：２００５一ｌ２．１６）
